FMD鑒別診斷抗原3ABC的原核表達(dá)與純化及RNAi抑制FMDV復(fù)制的初步研究.pdf

1、口蹄疫(foot-and-mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)引起的偶蹄類動物烈性傳染病,被國際獸疫局(Office International des Epizooties,OIE)列為A類傳染病之首.疫苗接種是防治FMD爆發(fā)的主要措施之一,而要控制FMD流行,首先要將病毒感染動物從疫苗接種群體中區(qū)分開來.該文分為兩部分,第一部分為:FMD鑒別診斷抗原

2、3ABC的原核表達(dá)與純化;第二部分為:RNAi抑制FMDV復(fù)制的初步研究.第一部分在大腸桿菌表達(dá)并純化FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC,旨在為研制FMDV感染和疫苗接種鑒別診斷試劑盒奠定基礎(chǔ).為構(gòu)建表達(dá)載體,擴(kuò)增了O型FMDV 3ABC片段,插入到原核表達(dá)載體pQE30Xa,利用PCR、雙酶切和測序進(jìn)行鑒定,成功構(gòu)建了重組載體pQE3ABC;轉(zhuǎn)化到M15(pREP4)和SG13009(pREP4)宿主菌中表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析,

3、大小為40kD左右,經(jīng)Western-blot檢測證明該融合蛋白可以與標(biāo)準(zhǔn)抗O型口蹄疫抗體發(fā)生特異性反應(yīng).優(yōu)化了重組質(zhì)粒pQE3ABC的表達(dá)條件,其結(jié)果為:氨芐青霉素和IPTG的適宜濃度分別為100 μg/mL和1mM,在M15(pREP4)和SG13009(pREP4)兩個(gè)宿主菌內(nèi)表達(dá)差異不顯著.利用鎳離子親和層析柱進(jìn)行融合蛋白純化,SDS-PAGE結(jié)果表明純化產(chǎn)物較為單一.利用稀釋復(fù)性法(超濾)對純化的融合蛋白進(jìn)行復(fù)性,并利用BCA

4、-蛋白質(zhì)定量測定試劑盒測得復(fù)性后的融合蛋白濃度為80-100μg/mL.該文第二部分為:利用RNAi抑制FMDV在BHK細(xì)胞中復(fù)制的初步研究,旨在為利用RNAi防治FMD做一些嘗試.FMDV基因組為單股正鏈RNA,既可作為基因組復(fù)制的模板,又可作為mRNA進(jìn)行蛋白質(zhì)翻譯,因而很適合于RNAi抗病毒的研究.根據(jù)FMDV IRES和L串聯(lián)序列兩側(cè)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了兩個(gè)引物,利用RT-PCR和PCR方法擴(kuò)增出該串聯(lián)序列,并進(jìn)行測序.測序結(jié)果表明

5、:IRES非常保守,未出現(xiàn)堿基差異;而L基因則出現(xiàn)了7個(gè)堿基突變.在測序的基礎(chǔ)上,選擇FMDV的毒力因子L作為靶基因,篩選位于啟始密碼子下游第229nt后21nt長的序列為靶位點(diǎn),在體外利用PCR方法合成了siRNA表達(dá)盒(SEC).細(xì)胞單層長成50-70%時(shí),用脂質(zhì)體將純化的SEC-L229轉(zhuǎn)染到BHK細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染4h后用FMDV接種細(xì)胞,24h后用間接免疫熒光方法檢測口蹄疫病毒在BHK細(xì)胞中的復(fù)制情況.研究結(jié)果表明:SEC-L229