煙草曲莖病毒復(fù)制相關(guān)蛋白基因原核表達條件優(yōu)化及核酸結(jié)合特性的初步研究.pdf

1、雙生病毒是一類世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的單鏈環(huán)狀DNA病毒，主要以滾環(huán)復(fù)制的方式進行病毒基因組的復(fù)制。與此類病毒致病性緊密相關(guān)的新型衛(wèi)星分子DNAβ依賴病毒DNA-A進行復(fù)制。為了進一步了解DNAβ復(fù)制的機制，本論文對煙草曲莖病毒(Tobacoocurlyshootvirus，TbCSV)的復(fù)制相關(guān)蛋白基因(replication-associatedprotein，Rep)進行了原核表達，并對Rep的核酸結(jié)合特性進行了初步研究。 為

2、了提高TbCSVRep在大腸桿菌(Escherichiacoli)中表達量，我們研究了大腸桿菌菌株、溫度、誘導(dǎo)時間以及誘導(dǎo)劑IPTG終濃度等不同條件對GST-Rep融合蛋白表達量的影響。結(jié)果表明，大腸桿菌菌株Rosetta在37℃培養(yǎng)3hr后，使用終濃度為0.5mmol/L的IPTG在28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4hr時，GST-Rep融合蛋白表達量最高，表達的GST-Rep融合蛋白可占細(xì)菌總蛋白的42％。用GST-Sepharose4B親和層析柱對

3、GST-Rep融合蛋白進行純化，SDS-PAGE表明GST-Rep融合蛋白大小約為66kDa，與預(yù)計的分子量大小一致，Westernblot分析表明其能與GST多克隆抗體起特異性反應(yīng)。Rep基因的優(yōu)化表達為研究該基因的作用機理打下基礎(chǔ)。 雙生病毒編碼的Rep具有結(jié)合核酸的能力。為了驗證Rep能否結(jié)合DNAβ，我們利用TbCSV-Y35Rep蛋白進行了核酸結(jié)合試驗。以全長TbCSV-Y35DNAβ分子作為探針，結(jié)果表明TbCSV-