CD133原核表達、純化和初步鑒定.pdf

1、目的:制備CD133特異性抗原用于篩選CD133噬菌體單鏈抗體文庫,使篩選產(chǎn)物能多與腫瘤干細胞表面的CD133抗原結(jié)合以達到靶向治療的目的。
　　 方法:用PCR擴增CD133第二、三兩段胞外區(qū),分別將擴增的兩段片段與pGEX4T-1(6*HIS)質(zhì)粒連接,酶切鑒定后測序驗證。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中并誘導表達,挑取單克隆培養(yǎng)后再經(jīng)酶切鑒定并測序驗證。取構(gòu)建成功的基因工程菌株于1000ml氨芐-LB培養(yǎng)液中生長,0.

2、4 mM IPTG37℃誘導過夜表達后,超聲裂解蛋白,取周質(zhì)和包涵體蛋白分別進行12％的SDS-PAGE凝膠電泳,隨后以考馬斯亮藍染色,選擇表達目的蛋白的菌株進一步大量表達,鎳柱純化。間接ELISA法鑒定目的抗原的特異性。
　　 結(jié)果:(1)將CD133分子二、三兩段胞外區(qū)PCR擴增后瓊脂凝膠電泳,在750bp處可見兩條亮帶與理論值符合相符,證明擴增成功；(2)第二、第三胞外區(qū)-pGEX4T-1目的基因雙酶切鑒定,1％瓊脂糖凝膠

3、電泳顯示在750bp處均可見插入的目的片段,序列檢測表明插入片段無突變。IPTG誘導表達相應(yīng)蛋白,經(jīng)超聲破碎,將上清和沉淀分別進行12％的SDS-PAGE凝膠電泳,目的蛋白在沉淀中表達量較多,說明目的蛋白主要表達在包涵體中；(3)經(jīng)間接ELISA初步鑒定表明純化后的第二、三CD133胞外片段蛋白與CD133抗體有特異性的結(jié)合。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建CD133胞外片段2及3的重組質(zhì)粒,原核表達并純化獲得CD133胞外結(jié)構(gòu)域2蛋白及