瓠瓜SSR和InDel分子標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用.pdf

1、葫蘆科約包括120屬，800種植物，其中包括很多有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的蔬菜和水果，如黃瓜（Cucumis sativusL.）、甜瓜（Cucumis meloL.）、西瓜(Citrullus lanatus(Thunb.)L.)、南瓜（Cucurbita maximaL.）等。瓠瓜作為重要的葫蘆科作物之一，在我國已有悠久的栽培歷史，考古學(xué)上的證據(jù)證明瓠瓜是人類最早馴化的物種之一。分子標(biāo)記的種類很多，其中SSR標(biāo)記已較為成熟，而InDel標(biāo)記可

2、作為新型標(biāo)記的代表。應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)可使人們對(duì)重要農(nóng)藝性狀的遺傳規(guī)律分析更加詳細(xì)可靠，提高育種親本選配的科學(xué)性，便于深入開展種質(zhì)資源研究，發(fā)掘重要基因資源，了解作物的起源和進(jìn)化關(guān)系。目前，瓠瓜分子標(biāo)記研究大大落后于黃瓜、白菜等作物。因此，應(yīng)用分子標(biāo)記技術(shù)開展瓠瓜種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，將對(duì)促進(jìn)瓠瓜重要種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有重要意義。
　　本實(shí)驗(yàn)先使用研究開發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)葫蘆科主要蔬菜作物間的親緣關(guān)系進(jìn)行了研究，然后

3、選擇了96份具有廣泛代表性的瓠瓜種質(zhì)材料，利用InDel分子標(biāo)記技術(shù)，研究分析了其遺傳多樣性和親緣關(guān)系，探討我國瓠瓜品種間的基因差異和瓠瓜亞種間及亞種內(nèi)的親緣關(guān)系。主要結(jié)果如下:
　　1.利用454GS-FLX Titanium System技術(shù)獲得瓠瓜基因組DNA序列信息，使用software mreps2.5(http://bioinfo.lifl.fr/mreps/)對(duì)這些瓠瓜序列進(jìn)行篩選，只挑選其中包含SSR序列長度不少于

4、20bp的序列設(shè)計(jì)SSR引物。用Websat(http://wsmartins.net/websat/)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共開發(fā)出400對(duì)瓠瓜SSR引物。為研究葫蘆科植物間的關(guān)系和系統(tǒng)發(fā)育，使用其中200對(duì)瓠瓜SSR引物對(duì)南瓜、西瓜、絲瓜和苦瓜基因組進(jìn)行了PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，瓠瓜SSR引物除在西瓜中擴(kuò)增率達(dá)到41％外，在其他瓜類基因中的擴(kuò)增率均不超過20％，這說明在本實(shí)驗(yàn)所使用的瓜類中，瓠瓜和西瓜的親緣關(guān)系最近。
　　經(jīng)與黃瓜、水稻

5、、小麥、大豆、普通菜豆和甜瓜進(jìn)行了CRY1和UDP-葡糖轉(zhuǎn)移酶基因BLAST比對(duì)，結(jié)果表明其中有13370條瓠瓜序列和黃瓜序列重疊部分在100bp以上。而在CRY1基因的對(duì)比中，瓠瓜與黃瓜的一致性高達(dá)93.5％; C端DAS也證明了這一點(diǎn)。這證明黃瓜和西瓜的親緣關(guān)系也較近。
　　2.應(yīng)用開發(fā)獲得的400個(gè)SSR標(biāo)記，對(duì)瓠瓜基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中挑選出14個(gè)擴(kuò)增穩(wěn)定、分離清晰的SSR標(biāo)記。利用14個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記研究44份瓠瓜

6、材料的多樣性中，主坐標(biāo)分析和聚類分析均表明，相對(duì)于不同種質(zhì)的原來源地而言，相同瓜型的材料有聚集在一起的趨勢，根據(jù)瓜型可將這44份瓠瓜種質(zhì)大致分為3類。
　　3.從前期利用RAD-seq技術(shù)開發(fā)獲得的947條InDel標(biāo)記中挑選85條差異片段超過10bp的差異性InDel標(biāo)記，對(duì)瓠瓜基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中挑選出22個(gè)擴(kuò)增穩(wěn)定、分離清晰的InDel標(biāo)記。應(yīng)用獲得的22個(gè)多態(tài)性InDel標(biāo)記，通過NTSYS-pc（2.1版）軟件對(duì)9

7、6份瓠瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了聚類分析，結(jié)果表明瓠瓜種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)變幅在0.36-1.00之間，將96份瓠瓜種質(zhì)材料在遺傳相似系數(shù)為0.68處分為8類;各種質(zhì)材料較平均地分布于圖中;相對(duì)于不同種質(zhì)的原來源地而言，相同瓜型的材料有聚集在一起的趨勢，根據(jù)瓜型可將這96份瓠瓜種質(zhì)大致分為3類。
　　綜上所述，我們開發(fā)了400對(duì)SSR標(biāo)記和947對(duì)InDel標(biāo)記，并將它們應(yīng)用于葫蘆科作物間親緣關(guān)系和瓠瓜種質(zhì)間的遺傳多樣性的研究，結(jié)果表明，