φC31-att介導(dǎo)的家蠶-細(xì)胞轉(zhuǎn)基因及基于GAL4-UAS雙元系統(tǒng)控制蛹期發(fā)育.pdf

1、φC31的位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)能夠有效地介導(dǎo)噬菌體attB位點(diǎn)和宿主attP位點(diǎn)之間的整合，本研究利用該系統(tǒng)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠶細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因家蠶。研究構(gòu)建了pSK-attB/Pie1-EGFP/Zeo-PASV40供體質(zhì)粒，其中φC31 attB位點(diǎn)下游具OpNPV的ie-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gfp-zeocin融合基因的表達(dá)盒；同時(shí)構(gòu)建了一個(gè)包含φC31整合酶基因瞬時(shí)表達(dá)盒的輔助質(zhì)粒pSK-Pie1/NLS-Int/NSL，其中兩側(cè)均帶有核定位信號(hào)序

2、列的φC31整合酶基因由BmNPV的ie-1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。在共轉(zhuǎn)染供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒的家蠶培養(yǎng)細(xì)胞中可檢測(cè)到gfp-zeocin融合基因的表達(dá)，反向PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果顯示，φC31整合酶可以準(zhǔn)確地識(shí)別和切割供體質(zhì)粒上的attB位點(diǎn)，并介導(dǎo)attB位點(diǎn)和細(xì)胞內(nèi)源性假attP位點(diǎn)之間的重組。同樣，將供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒通過精子介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入家蠶的卵中，通過綠色熒光篩選，結(jié)合gfp基因的PCR鑒定獲得轉(zhuǎn)基因家蠶，插入位點(diǎn)的傍側(cè)序列分析結(jié)果顯示，基于φ

3、C31的位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)可以將外源基因?qū)爰倚Q基因組。研究結(jié)果為家蠶遺傳操作提供了新的途徑和策略。
　　延長(zhǎng)家蠶的蛹期有可能實(shí)現(xiàn)繅絲工藝的重大改革。為了通過GAL4/UAS雙元系統(tǒng)在F1代蛹期特異性表達(dá)蛻皮甾醇尿苷二磷酸葡萄糖轉(zhuǎn)移酶基因（egt），明顯延緩蛹期發(fā)育，構(gòu)建了效應(yīng)系統(tǒng)載體piggyA3GFP-ie-neo-UAS-egt-polyA,（其中，egt基因由UAS控制表達(dá)）和激活系統(tǒng)載體piggyA3GFP-ie-neo

4、-BmWCP4-Gal4-polyA（其中，gal4的表達(dá)由BmWCP4啟動(dòng)子控制）；兩種載體均帶有A3啟動(dòng)子控制的gfp和BmNPV ie-1啟動(dòng)子控制的neo。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究已通過 piggyA3GFP-ie-neo-BmWCP4-Gal4-polyA介導(dǎo)，將BmWCP4-Gal4表達(dá)元件導(dǎo)入家蠶實(shí)用品種菁松，并篩選鑒定至G7代，此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步篩選、鑒定培育至G9代，獲菁松BmWCP4-Gal4系統(tǒng)；通過精子介導(dǎo)法將pi