斑點叉尾鮰天然Fab噬菌體抗體庫的構建.pdf

1、噬菌體抗體庫技術是近年來抗體技術研究中革命性的進展，利用此技術能夠快速有效地制備人源化抗體，并且可以篩選到具有高親和力的特異性抗體。目前此項技術在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中尚未見報道，基于斑點叉尾鮰抗體基因研究比較清楚，本文構建了其天然噬菌體抗體庫，具體工作如下：
　　 1.引物設計
　　 斑點叉尾鮰重鏈可變區(qū)分為13個VH家族，針對每個VH家族設計1對特異性引物，共13對。輕鏈有兩種類型，F(xiàn)鏈和G鏈，由于輕鏈基因序列同源性很高，因此

2、每種類型設計1對引物，共2對。所有引物兩端都帶有限制性酶切位點，5’引物位于免疫球蛋白可變區(qū)前導肽和N端第一骨架區(qū)（FRl），3’位于CH1或CL末端。
　　 2.輕鏈庫的構建
　　 取50尾健康斑點叉尾鮰新鮮外周血共250mL，分離淋巴細胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉錄獲得cDNA。PCR擴增抗體重鏈Fd和輕鏈基因片段，回收約650bp的抗體片段。將回收的PCR產(chǎn)物連接T載體（pT-Fd，pT-L），分別用SacI+XbaI

3、，SpeI+XhoI酶切，再次回收重鏈Fd和輕鏈基因片段。將第二次回收的輕鏈基因片段插入噬菌粒載體p3MH，重組后電轉化大腸桿菌XL1-BLue，構建輕鏈庫p3MH-L。取適量電轉化后的菌液鋪板培養(yǎng)，統(tǒng)計轉化子數(shù)，計算庫容。經(jīng)過多次轉化輕鏈庫庫容達到5.10×107。隨機挑取20個菌落，菌液PCR，電泳顯示18個菌落可見約650bp的輕鏈基因條帶，輕鏈庫重組率為90％。將質粒p3MH-L經(jīng)過SacI+XbaI酶切可見約650bp的插入片

4、段，說明輕鏈庫構建成功。
　　 3.抗體庫的構建
　　 將輕鏈庫質粒p3MH-L經(jīng)SpeI+XhoI雙酶切，回收載體大片段（約4.1kb），將其與第二次回收的重鏈Fd段基因連接，轉化大腸桿菌，按構建輕鏈庫的方法計算轉化率和插入效率。經(jīng)過4次轉化最終得到總庫容為5.67×107的抗體庫（p3MH-L-Fd），插入效率為90％?？贵w庫質粒經(jīng)XhoI單酶切，SpeI+XhoI雙酶切后可見插入的目的片段，說明抗體庫構建成功。