斑點(diǎn)叉尾鮰天然Fab噬菌體抗體庫的構(gòu)建.pdf

1、噬菌體抗體庫技術(shù)是近年來抗體技術(shù)研究中革命性的進(jìn)展，利用此技術(shù)能夠快速有效地制備人源化抗體，并且可以篩選到具有高親和力的特異性抗體。目前此項(xiàng)技術(shù)在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中尚未見報(bào)道，基于斑點(diǎn)叉尾鮰抗體基因研究比較清楚，本文構(gòu)建了其天然噬菌體抗體庫，具體工作如下：
　　 1.引物設(shè)計(jì)
　　 斑點(diǎn)叉尾鮰重鏈可變區(qū)分為13個(gè)VH家族，針對每個(gè)VH家族設(shè)計(jì)1對特異性引物，共13對。輕鏈有兩種類型，F(xiàn)鏈和G鏈，由于輕鏈基因序列同源性很高，因此

2、每種類型設(shè)計(jì)1對引物，共2對。所有引物兩端都帶有限制性酶切位點(diǎn)，5’引物位于免疫球蛋白可變區(qū)前導(dǎo)肽和N端第一骨架區(qū)（FRl），3’位于CH1或CL末端。
　　 2.輕鏈庫的構(gòu)建
　　 取50尾健康斑點(diǎn)叉尾鮰新鮮外周血共250mL，分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。PCR擴(kuò)增抗體重鏈Fd和輕鏈基因片段，回收約650bp的抗體片段。將回收的PCR產(chǎn)物連接T載體（pT-Fd，pT-L），分別用SacI+XbaI

3、，SpeI+XhoI酶切，再次回收重鏈Fd和輕鏈基因片段。將第二次回收的輕鏈基因片段插入噬菌粒載體p3MH，重組后電轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-BLue，構(gòu)建輕鏈庫p3MH-L。取適量電轉(zhuǎn)化后的菌液鋪板培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)，計(jì)算庫容。經(jīng)過多次轉(zhuǎn)化輕鏈庫庫容達(dá)到5.10×107。隨機(jī)挑取20個(gè)菌落，菌液PCR，電泳顯示18個(gè)菌落可見約650bp的輕鏈基因條帶，輕鏈庫重組率為90％。將質(zhì)粒p3MH-L經(jīng)過SacI+XbaI酶切可見約650bp的插入片

4、段，說明輕鏈庫構(gòu)建成功。
　　 3.抗體庫的構(gòu)建
　　 將輕鏈庫質(zhì)粒p3MH-L經(jīng)SpeI+XhoI雙酶切，回收載體大片段（約4.1kb），將其與第二次回收的重鏈Fd段基因連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，按構(gòu)建輕鏈庫的方法計(jì)算轉(zhuǎn)化率和插入效率。經(jīng)過4次轉(zhuǎn)化最終得到總庫容為5.67×107的抗體庫（p3MH-L-Fd），插入效率為90％。抗體庫質(zhì)粒經(jīng)XhoI單酶切，SpeI+XhoI雙酶切后可見插入的目的片段，說明抗體庫構(gòu)建成功。