鯽魚IgM單鏈抗體的制備及嗜水氣單胞菌抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、魚類的免疫系統(tǒng)在抵御病原入侵及感染后疾病的恢復(fù)上起到了關(guān)鍵作用。其中，IgM是魚類特異性免疫應(yīng)答中最主要的介質(zhì)。目前，血清抗體效價的高低已經(jīng)成為反映水生動物免疫水平較為理想和可靠的指標(biāo)。因此，建立檢測魚類血清中IgM的方法，對于深入了解魚類體液免疫應(yīng)答的規(guī)律，有效監(jiān)測魚類疫苗的免疫效果及疾病的感染情況有著重要的意義。
　　單鏈抗體(scFv)是將抗體的重鏈、輕鏈可變區(qū)通過一條彈性肽鏈連接物(Linker)首尾相接組成的重組蛋白，保

2、持著天然抗體的特異性和大致接近的親和力。其具有分子量小、易于基因工程改造、便于大量生產(chǎn)等優(yōu)點，因此比完整長度的單克隆抗體具有更大的優(yōu)勢和發(fā)展前景。
　　本試驗對實驗室制備和保存的小鼠抗鯽魚IgM單克隆抗體（mAb）進(jìn)行了單鏈抗體的構(gòu)建。以mAbF3a為研究對象，利用Trizol法提取F3a的總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，利用PCR方法擴(kuò)增重鏈、輕鏈可變區(qū)基因片段，利用重疊延伸PCR方法將重鏈、輕鏈通過Linker連接起來構(gòu)建F3

3、a-scFv，并將其插入原核表達(dá)載體pET32a(+)中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)測序正確后，陽性克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE分析，目的蛋白大小在45kDa左右，主要以包涵體形式存在。對表達(dá)產(chǎn)物應(yīng)用Ni-NSTHis-BindResin進(jìn)行純化后，進(jìn)行脲梯度透析復(fù)性，并對其進(jìn)行超濾濃縮，得到目的蛋白濃度為2.6mg/mL。間接ELISA和Westernblotting證實F3a-scFv復(fù)性后具有良好的

4、免疫反應(yīng)性。
　　為了有效地監(jiān)測魚類疫苗的免疫效果及疾病的感染情況，本試驗以滅活嗜水氣單胞菌為包被抗原，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗鯽魚IgM的單鏈抗體為酶標(biāo)二抗，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化建立了檢測鯽魚血清中IgM抗體水平的間接ELISA方法。實驗所確定的間接ELISA最佳反應(yīng)條件為:包被抗原最適工作濃度為108cfu/mL，最佳包被條件是4℃過夜;一抗（血清）最佳稀釋度為1∶160;最佳封閉條件是以5％脫脂奶，37℃封閉1.5h;

5、抗原抗體最佳作用時間為1.5h;酶標(biāo)二抗最佳作用稀釋度為1∶50，作用時間為1h;TMB底物顯色條件為28℃溫育10min。以O(shè)D450值≥0.0963判為陽性，樣品OD450值＜0.0831時判為陰性，0.0831≤樣品OD值＜0.0963時判定為可疑。敏感性試驗顯示當(dāng)血清稀釋度達(dá)1∶2560時，陽性樣品檢測結(jié)果仍為陽性，表明所建立的間接ELISA方法敏感性較好。批次內(nèi)重復(fù)性試驗的變異系數(shù)在1.2％-5.3％之間，批次間重復(fù)性試驗的變

6、異系數(shù)在1.36％-6.7％之間，均小于10％,表明所建立的間接ELISA方法重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。運用已建立的間接ELISA方法檢測鯽魚不同免疫和感染時期血清中IgM抗體的水平，結(jié)果顯示:免疫組和感染組10d前的血清抗體水平均為陰性，10d開始呈現(xiàn)上升趨勢，免疫組在35-40d時血清IgM抗體水平達(dá)到最高，而感染組在30-35d時達(dá)到最高，此后兩組的血清IgM抗體水平開始下降;直到60d時，免疫組IgM抗體水平仍較高，而感染組檢測結(jié)果也