白菜(Brassica campestris)浸花法轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究.pdf

1、白菜(包括結(jié)球白菜和不結(jié)球白菜)在亞洲特別是中國(guó)、日本和韓國(guó)是最重要的蔬菜。白菜的生產(chǎn)過(guò)程易受蟲(chóng)害侵?jǐn)_,且需水量大。通過(guò)基因工程導(dǎo)入外源基因,可以創(chuàng)造出白菜的新種質(zhì),進(jìn)而從根本上改變白菜種質(zhì)資源。
　　農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花(floral-dip)轉(zhuǎn)化方法是近年發(fā)展起來(lái)的一種較簡(jiǎn)便的不依賴組織培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以避開(kāi)組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng),直接獲得轉(zhuǎn)基因的種子,而且相對(duì)于真空轉(zhuǎn)化,對(duì)儀器設(shè)備要求較低。因此,該轉(zhuǎn)化方法適用于

2、難以進(jìn)行組織培養(yǎng)和離體再生的植物。本研究以攜帶 pBBB-intron-gus質(zhì)粒的農(nóng)桿菌C58為轉(zhuǎn)化用工程菌,對(duì)5個(gè)結(jié)球白菜品系(08-1083-2,08-1084-2,02-311,02-507,06-940)和不結(jié)球白菜四九菜心進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花轉(zhuǎn)化,以期為探索功能基因?qū)氚撞嘶铙w的方法提供一定的理論根據(jù)。其中大白菜品系08-1083-2收獲了14棵抗性株,經(jīng)鑒定后證明沒(méi)有獲得轉(zhuǎn)化株,不結(jié)球白菜四九菜心獲得4棵抗性株,GUS檢測(cè)

3、為非真實(shí)轉(zhuǎn)化株。
　　為了進(jìn)一步探討農(nóng)桿菌通過(guò)浸花處理難以進(jìn)入白菜花器官的可能原因,對(duì)擬南芥和四九菜心兩種材料不同發(fā)育階段的花蕾進(jìn)行形態(tài)及解剖觀察,以研究二者在花發(fā)育節(jié)律及形態(tài)結(jié)構(gòu)上的差異。結(jié)果顯示,兩種材料均是幼嫩子房時(shí)成開(kāi)口杯狀,隨著花蕾長(zhǎng)大,心皮逐漸閉合;調(diào)查新生花蕾在花序總花蕾中所占的比例,四九菜心為20％,而擬南芥高達(dá)62.6％;綜合形態(tài)及解剖觀察結(jié)果,可以推斷花蕾期心皮閉合至開(kāi)花的時(shí)間,四九菜心約為15天,而擬南芥僅需

4、3天。有研究指出,開(kāi)放的心皮形成的孔道可能是是農(nóng)桿菌進(jìn)入供試材料體內(nèi)的途徑之一,而浸花法轉(zhuǎn)化發(fā)生的部位大多在未成熟花蕾中。由此可以推斷,過(guò)早閉合的心皮可能是造成農(nóng)桿菌不能順利進(jìn)入四九菜心的原因之一,而新生花蕾占總花蕾比例較低造成四九菜心轉(zhuǎn)化率的降低。
　　為了證實(shí)這一推測(cè),本研究對(duì)不結(jié)球白菜引心360和擬南芥進(jìn)行了平行浸花實(shí)驗(yàn),分析供試材料花器官中農(nóng)桿菌數(shù)量的差異,試圖闡釋白菜轉(zhuǎn)化率低的原因。首先以含0.225g/L ppt除草劑

5、 Basta的溶液噴施處理株收獲的種子,對(duì)照材料獲得了抗性株(3株),其植株轉(zhuǎn)化率為20％,而引心360沒(méi)有獲得抗性株。GUS檢測(cè)證明擬南芥抗性株中外源基因得以表達(dá)。然后采用細(xì)菌平板培養(yǎng)法,研究處理材料花蕾內(nèi)農(nóng)桿菌的數(shù)量差異。結(jié)果表明,在浸花處理后的6天內(nèi),在添加擬南芥花蕾提取物的篩選平板上,仍能培養(yǎng)出60-900的菌落數(shù)(s/g),而在加白菜花蕾提取液的平板上,菌落形成單位為0。這說(shuō)明農(nóng)桿菌很難通過(guò)浸花處理進(jìn)入白菜花器官內(nèi),在一定程度