λRed重組和CRISPR-Cas9技術在構建禽病原性大腸桿菌ahpF、yfgC基因突變株中的運用.pdf

1、大腸桿菌是溫血動物包括人在內的腸道中的正常菌群之一，大部分為非致病性菌株，少數則具有致病性。致病性大腸桿菌可分為腸道致病性大腸桿菌和腸道外致病性大腸桿菌(ExPEC)兩大類，禽致病性大腸桿菌（avian pathogenic E.coli，APEC）屬于ExPEC的成員，定植于腸道外，可以引發(fā)禽的局部感染或全身感染性疾病-大腸桿菌病。禽大腸桿菌病已成為最嚴重的細菌性傳染病之一，給全球養(yǎng)禽業(yè)帶來了嚴重的經濟損失。已發(fā)現APEC擁有多種致病

2、因子，并且還有新的致病因子在不斷地被發(fā)現被研究?；蛲蛔兪茄芯炕蚬δ艿闹匾夹g手段。
　　抗氧化防御系統(tǒng)是細菌保護自身免受代謝過程中產生的過氧化物損傷的一種保護性機制，ahpF基因就是抗氧化防御系統(tǒng)中的一員，它與ahpC一起作用將內源性H2O2催化成相應的醇和H2O，從而清除代謝過程中產生的H2O2，以減少對細菌自身的傷害。另一個研究的基因yfgC和細菌的外膜蛋白保持著緊密的聯系，它可以降解錯誤折疊的外膜蛋白，對細菌外膜蛋白的完

3、整性起到重要的作用。但是目前來說，它的具體作用機制尚不清楚。本研究旨在研究ahpF、yfgC基因與APEC致病性之間的關系，為揭示APEC的致病機理及進一步構建APEC弱毒疫苗株奠定基礎。
　　運用λRed重組系統(tǒng)和CRISPR/Cas9系統(tǒng)構建了E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3、E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2、E058ΔyfgC-3基因缺失突變株，同時將帶有相應啟動子的ahp

4、F、yfgC基因完整閱讀框插入低拷貝載體pACYC184中，通過電轉化突變株來篩選獲取回復株。RT-PCR結果表明E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3、E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2基因均不能轉錄，而其上下游基因的轉錄不受影響，E058ΔyfgC-3發(fā)生了意外轉錄。
　　半數致死量試驗結果表明，與野生株相比，E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2、E058ΔyfgC-3突變

5、株的致病力顯著降低，而E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3突變株致弱不明顯。35日齡SPF雞體內定居與持續(xù)試驗結果表明，E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-2、E058ΔyfgC-3突變株在各臟器的定居與持續(xù)能力均顯著低于野生株E058。生長曲線的測定結果顯示，在LB培養(yǎng)基中，各突變株生長速度與野生株相似，并未表現出明顯差異，但在加入H2O2培養(yǎng)基中，E058ΔyfgC-1、E058ΔyfgC-

6、2、E058ΔyfgC-3突變株的生長速度顯著低于野生株，而E058ΔahpF-1、E058ΔahpF-2、E058ΔahpF-3突變株生長速度反而快于野生株的生長速度。血清殺菌試驗顯示各突變株和野生株沒有表現出顯著差異。體外競爭試驗結果顯示，在LB培養(yǎng)基中，均表現為輕度致弱。這些結果表明，yfgC與APEC E058菌株的致病性高度相關，而ahpF不影響APEC的致病性。而用兩種方法突變的突變株，從致病性來看，有細微的差別，但不是很明