ChTLR15基因的多態(tài)性和脾臟中的表達(dá)水平與腸炎沙門(mén)氏菌感染的相關(guān)性研究.pdf

1、腸炎沙門(mén)氏菌(Salmonella enteritidis,SE)是當(dāng)前養(yǎng)禽業(yè)較為普遍且不易受重視的食物源性病原菌,成年雞表現(xiàn)為隱性感染且長(zhǎng)期排菌,容易為生產(chǎn)所忽視,對(duì)禽類(lèi)生產(chǎn)造成的直接和間接經(jīng)濟(jì)損失無(wú)法估量,而且對(duì)人類(lèi)的身體健康也造成很?chē)?yán)重的危害。從長(zhǎng)遠(yuǎn)發(fā)展考慮,尋求一種全新的預(yù)防與控制策略,采用遺傳學(xué)方法,培育出抗病新品種(品系),從遺傳素質(zhì)上永久性地提高雞群對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的抵抗能力,培育高效、優(yōu)質(zhì)、抗性雞種是實(shí)現(xiàn)養(yǎng)禽業(yè)可持續(xù)發(fā)展的

2、迫切需要。
　　 一直以來(lái),遺傳學(xué)家和免疫學(xué)家都推崇“基因決定動(dòng)物抗性學(xué)說(shuō)”,即一些動(dòng)物傳染性疾病的發(fā)病機(jī)制與動(dòng)物本身的遺傳背景有關(guān),可能受單個(gè)或多個(gè)抗性基因控制,亦即動(dòng)物可能對(duì)一些傳染性疾病存在完全或部分抵抗力。宿主的遺傳背景對(duì)SE的抗性有著深遠(yuǎn)的影響,探索相關(guān)基因的差異表達(dá)規(guī)律是研究雞對(duì)SE抗性的必要途徑。因此必須立足于基本,對(duì)國(guó)內(nèi)地方雞種腸炎沙門(mén)氏菌抗性遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行深入研究,是解決國(guó)內(nèi)地方雞種腸炎沙門(mén)氏菌病抗病育種的關(guān)鍵科

3、學(xué)問(wèn)題。
　　 Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)是一種先天免疫模式識(shí)別受體,可通過(guò)識(shí)別并結(jié)合一種或多種病原相關(guān)分子模式,將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息向細(xì)胞內(nèi)傳遞并引發(fā)炎癥反應(yīng),其為疾病機(jī)制的研究提供了方向,成為目前研究禽類(lèi)抗病力的重要候選標(biāo)記基因之一。TLR15是近來(lái)發(fā)現(xiàn)的禽類(lèi)所特有的Toil樣受體,目前的研究和發(fā)現(xiàn)提示雞TLR15(ChTLR15)與雞腸炎沙門(mén)氏菌病抗性存在著密切關(guān)系,關(guān)于ChTLR15在

4、家禽異嗜性粒細(xì)胞中的表達(dá)水平以及其和家禽抵抗病原微生物的感染能力的關(guān)系是最近研究的焦點(diǎn)。宿主的遺傳背景對(duì)SE的抗性有著深遠(yuǎn)的影響,不同種屬動(dòng)物的抗性基因?qū)μ囟ú≡a(chǎn)生毒素的敏感性和引發(fā)的免疫反應(yīng)類(lèi)型差異很大,探索相關(guān)基因的差異表達(dá)規(guī)律足研究雞對(duì)SE抗性的必要途徑。
　　 本研究以中國(guó)地方雞種存在對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌抗性的遺傳差異為切入點(diǎn),進(jìn)行腸炎沙門(mén)氏菌攻毒試驗(yàn),以模式識(shí)別受體相關(guān)基因ChTLR15作為研究對(duì)象,從mRNA和DNA水

5、平,采用以實(shí)時(shí)熒光定量PCR為主的基因差異表達(dá)分析,結(jié)合基因序列多態(tài)性掃描,探討腸炎沙門(mén)氏菌攻毒后對(duì)中國(guó)地方鴆生長(zhǎng)早期脾臟TLR15 mRNA表達(dá)的影響,為進(jìn)一步揭示TLR15與雞腸炎沙門(mén)氏菌病抗性的相關(guān)性和中國(guó)地方雞種腸炎沙門(mén)氏菌抗病力差異的分子遺傳機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支撐。本研究分以下三部分:
　　 1清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞SE天然感染率的比較以及ChTLR15基因多態(tài)性分布與SE感染的關(guān)系
　　 本研究以中國(guó)地方雞品種

6、清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞種母雞為研究對(duì)象,通過(guò)平板凝集試驗(yàn)對(duì)兩個(gè)世代進(jìn)行沙門(mén)氏菌自然感染情況的評(píng)估,白耳雞和清遠(yuǎn)麻雞世代1的雞白痢陰性感染率分別為41.41％和58.82％,世代2的陰性感染率分別為48.83％和66.3％。白耳雞和清遠(yuǎn)麻雞世代1腸炎沙門(mén)氏菌陰性感染率分別為68.69％和76.47％。結(jié)果提示天然感染率的結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定,清遠(yuǎn)麻雞對(duì)雞白痢和腸炎沙門(mén)氏菌的天然感染率均低于白耳雞,提示清遠(yuǎn)麻雞的易感性低于白耳雞。通過(guò)PCR-SSCP的方

7、法對(duì)清遠(yuǎn)麻鴆和白耳雞ChTLR15基因僅有的一個(gè)外顯子區(qū)域進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(SNPs)掃描,共檢測(cè)到三個(gè)多態(tài)位點(diǎn),分別為G168A、C726T和A1166G的突變。其中,G168A和C726T為沉默突變,A1166G引起編碼氨基酸由賴氨酸(Lys)變?yōu)榫彼?Arg)。分析三個(gè)SNPs基因型頻率和基因頻率分布,發(fā)現(xiàn)G168A在兩個(gè)品種間基因型分布無(wú)顯著差異(P＞0.05);C726T和A1166G在白耳雞與清遠(yuǎn)麻雞基因型分布差異顯著(

8、P＜0.05,P＜0.01)。群體遺傳特性分析發(fā)現(xiàn),G168A位點(diǎn)在白耳雞群中為低度多態(tài)(PIC＜0.25),在清遠(yuǎn)麻雞群為中度多態(tài)(0.5＞PIC＞0.25);C726T位點(diǎn)在白耳雞群和清遠(yuǎn)麻鴆群為中度多態(tài)(0.5＞PIC＞0.25);在A1166G位點(diǎn)白耳雞達(dá)到高度多態(tài)(PIC＞0.5),而清遠(yuǎn)麻雞在該位點(diǎn)為低度多態(tài)。分析ChTLR15基因SNP位點(diǎn)的基因型分布與腸炎沙門(mén)氏菌感染情況的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)白耳雞C726T多態(tài)位點(diǎn)的基因型在感

9、染陽(yáng)性組和陰性組間的分布差異顯著(x2=8.84,P＜0.05),陰性組BB基因型數(shù)明顯多于陽(yáng)性組,B(T)等位基因頻率陰性組比陽(yáng)性組高18％,提示T等位基因可能是抵抗腸炎沙門(mén)氏菌感染的有利基因。其它SNP位點(diǎn)在感染陽(yáng)性組和陰性組間的分布均無(wú)顯著差異,提示G168A、C726T(在清遠(yuǎn)麻雞中)和A1166G突變位點(diǎn)基因型分布與腸炎沙門(mén)氏菌感染無(wú)明顯相關(guān)。
　　 2清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞雛雞腸炎沙門(mén)氏菌LD50測(cè)定以及腸炎沙門(mén)氏菌感染對(duì)

10、雛雞生長(zhǎng)的影響
　　 為評(píng)價(jià)清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌的敏感性,先后進(jìn)行兩次半數(shù)致死量試驗(yàn),試驗(yàn)一未設(shè)性別分組,試驗(yàn)二進(jìn)行性別分組,將沙門(mén)氏菌母源抗體0效價(jià)雛雞分別分為一個(gè)對(duì)照組和四個(gè)攻毒組,2日齡時(shí)經(jīng)頸部皮下注射途徑分別對(duì)各攻毒組雛雞接種106、107、108、109 cfu劑量組的腸炎沙門(mén)氏菌,對(duì)照組注射PBS。觀察接種后各實(shí)驗(yàn)組雞的臨床變化和死亡情況,進(jìn)行細(xì)菌學(xué)鑒定,測(cè)定半數(shù)致死量(LD50),試驗(yàn)一清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞的

11、LD50的結(jié)果分別為5.89×107cfu和1.10×108cfu,試驗(yàn)二分別為1.29×108 cfu和1.5×108 cfu,其中雄性清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞LD50分別為3.18×108 cfu和1.29×108 cfu,雌性清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞LD50分別為4.22×107 cfu和1.79×108cfu。LD50的結(jié)果表明兩個(gè)雞種對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌病的敏感性在品種和性別間差異不顯著。細(xì)菌分離攀定結(jié)果顯示,SE在感染雛雞肝、脾、肺、腎和盲腸中均

12、有分布,且經(jīng)鑒定與接種菌株一致,各攻毒組臟器均表現(xiàn)出不同程度的病變。通過(guò)LD50結(jié)果,選擇100％存活的106cfu劑量組進(jìn)行攻毒,觀察對(duì)照組和攻毒組生長(zhǎng)情況,并于第1,3和10天采集脾臟樣本。腸炎沙門(mén)氏菌攻毒后,清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞的增重受到處理和日齡交互效應(yīng)的顯著影響,在品種內(nèi)(F197=7.7,P=0.000;F342=16.1,P=0.000)和品種間(F142=7.5,P=0.000;F439=16.8,P=0.000)都差異極顯

13、著。白耳雞在PBS處理后的第1天,對(duì)照組體重顯著低于出雛重(P=0.0257),體重呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng),此體重下降可能足由于受到抓捕刺激引起的,在處理后第3天,對(duì)照組試驗(yàn)雞體葦開(kāi)始正增長(zhǎng),顯著高于出雛重(P=0.0000);而清遠(yuǎn)麻雞對(duì)照組的體重在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)一直表現(xiàn)為正增長(zhǎng),這一結(jié)果提示清遠(yuǎn)麻雞的抗逆能力比白耳雞強(qiáng)。白耳雞在攻毒后的第1天和第3天攻毒組體重均顯著低于出雛重(P=0.0047,0.0003),體重呈現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng):到攻毒后第8天攻毒組體

14、重才超過(guò)出雛重,說(shuō)明白耳雞攻毒組的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的阻滯;清遠(yuǎn)麻雞攻毒組體重雖然一直低于對(duì)照組,但是在攻毒的第1天,攻毒組體重和出雛重沒(méi)有差異(P=0.1446),在攻毒后第3天,已經(jīng)顯著高于出雛重(P=0.0000),表現(xiàn)出正增長(zhǎng)。攻毒組除了受到抓捕應(yīng)激外還受到腸炎沙門(mén)氏菌攻毒的影響,在攻毒劑量一致和白耳雞的出雛重高于清遠(yuǎn)麻雞(P=0.000)的情況下,提示白耳雞比清遠(yuǎn)麻雞對(duì)腸炎沙門(mén)氏菌感染更加敏感。
　　 3ChTLR15 mR

15、NA在脾臟中表達(dá)水平的變化與腸炎沙門(mén)氏菌感染關(guān)系的研究
　　 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法,比較兩個(gè)品種鴆脾臟樣品中攻毒組和對(duì)照組(試驗(yàn)二)ChTLR15 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,在三個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩個(gè)品種試驗(yàn)雞脾臟中ChTLR15 mRNA的表達(dá)均顯著上調(diào),其中白耳雞在感染后第1天他和第3天攻毒組ChTLR15的表達(dá)均極顯著上調(diào)(P=0.003,0.001),清遠(yuǎn)雞在感染后三個(gè)時(shí)間點(diǎn)攻毒組ChTLR15的表

16、達(dá)水平均呈現(xiàn)極顯著上調(diào)(P=0.016,0.002,0.001)。白耳雞的攻毒組內(nèi)和清遠(yuǎn)麻鴆的攻毒組內(nèi)ChTLR15的表達(dá)在時(shí)間上沒(méi)有顯著差異,說(shuō)明在腸炎沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中,脾臟中ChTLR15 mRNA從第1天到第12天表現(xiàn)為持續(xù)的高表達(dá)。在攻毒后第1天,清遠(yuǎn)麻雞攻毒組的ChTLR15表達(dá)顯著低于白耳雞;其他時(shí)間點(diǎn)清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞對(duì)照組和攻毒組ChTLR15的mRNA表達(dá)沒(méi)有差異。綜上所述,ChTLR15基因在雞沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中參與