Meq基因增強RNA沉默的分子機制及其介導病毒抗性的研究.pdf

1、Meq基因是馬立克氏病病毒的主要致瘤基因，MEQ蛋白N端為堿性亮氨酸拉鏈結構域，C端為富含脯氨酸結構域，在馬立克氏病病毒的增殖和致病中起重要作用。農(nóng)桿菌瞬時侵染分析表明，MEQ能明顯增強植物瞬時侵染介導的RNA沉默，而RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的主要防御策略，對于MEQ沉默增強機制的研究，可以使我們了解RNA沉默途徑及機制的更多細節(jié)，同時為利用沉默增強基因獲得植物廣譜病毒抗性提供依據(jù)。為了揭示MEQ增強RNA沉默的分子機制，針對亮氨酸

2、拉鏈和轉錄激活結構域分別構建了缺失突變體和點突變體，分析沉默增強作用的關鍵位點和功能域;熒光定量PCR檢測Meq基因對沉默途徑相關基因表達的影響，探討其介入RNA沉默途徑的可能方式;利用葉盤法和花序侵染法將Meq基因分別轉化煙草和擬南芥，接種病毒進行抗性分析。主要的研究結果如下:
　　(1) Meq基因能夠顯著增強瞬時侵染介導的局部和系統(tǒng)性RNA沉默。構建Meq基因植物表達載體，轉化農(nóng)桿菌GV3101，以GFP轉基因本生煙16c為

3、材料，農(nóng)桿菌瞬時侵染鑒定其對RNA沉默的影響，長波紫外燈下持續(xù)觀察綠色熒光蛋白的表達。結果表明，侵染后第3d(3dpi)，MEQ與GFP共侵染處理已無綠色熒光，而GFP單獨侵染仍有較強綠色熒光，Northern blot檢測表明，GFP mRNA的積累水平與觀察結果一致，而MEQ與GFP共侵染區(qū)GFP siRNA的積累水平顯著高于GFP基因的單獨侵染。侵染15dpi，MEQ與GFP共侵染與GFP單獨侵染相比，植株上部有更多新生葉片變紅，

4、GFP mRNA的積累水平更低，發(fā)生了更強的系統(tǒng)性RNA沉默。
　　(2) MEQ蛋白包含399個氨基酸，1-117位為DNA結合結構域，118-399位為轉錄激活結構域，其中1-28位為富含Pro/Gln區(qū)，有與轉錄輔阻遏物CtBp互作的位點，28-78位包含2個富含堿性氨基酸殘基的DNA結合區(qū)及核定位信號，79-117位為亮氨酸拉鏈區(qū)。突變分析表明，△1-28突變體不影響沉默增強功能，而△1-78突變體卻喪失了沉默增強功能，說

5、明28-78之間的DNA結合區(qū)對MEQ的沉默增強功能是必須的?！?18-399的突變使MEQ沉默增強能力喪失，而△175-399突變和△302-399突變都未對沉默增強功能產(chǎn)生影響，說明MEQ的轉錄激活結構域中118-174是發(fā)揮RNA沉默增強功能的核心區(qū)。將MEQ亮氨酸拉鏈中的亮氨酸突變掉2個或3個(L92AL99A和L92AL99AL106A)時其沉默增強功能明顯減弱，而僅有1個亮氨酸突變(L92A)不影響其沉默增強功能，這說明亮氨

6、酸拉鏈結構對MEQ蛋白發(fā)揮作用非常關鍵。亞細胞定位分析表明，與GFP融合表達的MEQ主要分布于細胞核中，而沉默增強功能需要MEQ的DNA結合結構域和轉錄激活結構域共同起作用，因此推測，MEQ可能以轉錄因子的方式通過調(diào)控其它基因的表達發(fā)揮RNA沉默增強功能。
　　(3)為了進一步了解MEQ影響沉默途徑的方式，選取本生煙中20個已知的沉默途徑相關基因，通過熒光定量PCR檢測MEQ基因瞬時侵染對這些基因表達的影響。結果顯示，在所檢測的基

7、因中，有7個表達量明顯上調(diào)，AGO10和HEN1基因的表達上調(diào)最為明顯，其次為MET1、NRPD2a、SGS3、AGO1a和DRM3基因。其中HEN1、MET1、NRPD2a、SGS3和DRM3基因與DNA甲基化有關，其余2個基因屬于AGO蛋白家族，是RNA沉默途徑的重要蛋白，由此推測，Meq基因可能通過影響AGO基因的表達介入RNA沉默途徑，同時對DNA的甲基化有影響，但二者之間是否存在聯(lián)系還需要進一步研究驗證。
　　(4) M