Meq基因增強(qiáng)RNA沉默的分子機(jī)制及其介導(dǎo)病毒抗性的研究.pdf

1、Meq基因是馬立克氏病病毒的主要致瘤基因，MEQ蛋白N端為堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，C端為富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域，在馬立克氏病病毒的增殖和致病中起重要作用。農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染分析表明，MEQ能明顯增強(qiáng)植物瞬時(shí)侵染介導(dǎo)的RNA沉默，而RNA沉默是植物抵抗病毒侵染的主要防御策略，對(duì)于MEQ沉默增強(qiáng)機(jī)制的研究，可以使我們了解RNA沉默途徑及機(jī)制的更多細(xì)節(jié)，同時(shí)為利用沉默增強(qiáng)基因獲得植物廣譜病毒抗性提供依據(jù)。為了揭示MEQ增強(qiáng)RNA沉默的分子機(jī)制，針對(duì)亮氨酸

2、拉鏈和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域分別構(gòu)建了缺失突變體和點(diǎn)突變體，分析沉默增強(qiáng)作用的關(guān)鍵位點(diǎn)和功能域;熒光定量PCR檢測(cè)Meq基因?qū)Τ聊緩较嚓P(guān)基因表達(dá)的影響，探討其介入RNA沉默途徑的可能方式;利用葉盤(pán)法和花序侵染法將Meq基因分別轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，接種病毒進(jìn)行抗性分析。主要的研究結(jié)果如下:
　　(1) Meq基因能夠顯著增強(qiáng)瞬時(shí)侵染介導(dǎo)的局部和系統(tǒng)性RNA沉默。構(gòu)建Meq基因植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，以GFP轉(zhuǎn)基因本生煙16c為

3、材料，農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染鑒定其對(duì)RNA沉默的影響，長(zhǎng)波紫外燈下持續(xù)觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，侵染后第3d(3dpi)，MEQ與GFP共侵染處理已無(wú)綠色熒光，而GFP單獨(dú)侵染仍有較強(qiáng)綠色熒光，Northern blot檢測(cè)表明，GFP mRNA的積累水平與觀察結(jié)果一致，而MEQ與GFP共侵染區(qū)GFP siRNA的積累水平顯著高于GFP基因的單獨(dú)侵染。侵染15dpi，MEQ與GFP共侵染與GFP單獨(dú)侵染相比，植株上部有更多新生葉片變紅，

4、GFP mRNA的積累水平更低，發(fā)生了更強(qiáng)的系統(tǒng)性RNA沉默。
　　(2) MEQ蛋白包含399個(gè)氨基酸，1-117位為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，118-399位為轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，其中1-28位為富含Pro/Gln區(qū)，有與轉(zhuǎn)錄輔阻遏物CtBp互作的位點(diǎn)，28-78位包含2個(gè)富含堿性氨基酸殘基的DNA結(jié)合區(qū)及核定位信號(hào)，79-117位為亮氨酸拉鏈區(qū)。突變分析表明，△1-28突變體不影響沉默增強(qiáng)功能，而△1-78突變體卻喪失了沉默增強(qiáng)功能，說(shuō)

5、明28-78之間的DNA結(jié)合區(qū)對(duì)MEQ的沉默增強(qiáng)功能是必須的?！?18-399的突變使MEQ沉默增強(qiáng)能力喪失，而△175-399突變和△302-399突變都未對(duì)沉默增強(qiáng)功能產(chǎn)生影響，說(shuō)明MEQ的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域中118-174是發(fā)揮RNA沉默增強(qiáng)功能的核心區(qū)。將MEQ亮氨酸拉鏈中的亮氨酸突變掉2個(gè)或3個(gè)(L92AL99A和L92AL99AL106A)時(shí)其沉默增強(qiáng)功能明顯減弱，而僅有1個(gè)亮氨酸突變(L92A)不影響其沉默增強(qiáng)功能，這說(shuō)明亮氨

6、酸拉鏈結(jié)構(gòu)對(duì)MEQ蛋白發(fā)揮作用非常關(guān)鍵。亞細(xì)胞定位分析表明，與GFP融合表達(dá)的MEQ主要分布于細(xì)胞核中，而沉默增強(qiáng)功能需要MEQ的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域共同起作用，因此推測(cè)，MEQ可能以轉(zhuǎn)錄因子的方式通過(guò)調(diào)控其它基因的表達(dá)發(fā)揮RNA沉默增強(qiáng)功能。
　　(3)為了進(jìn)一步了解MEQ影響沉默途徑的方式，選取本生煙中20個(gè)已知的沉默途徑相關(guān)基因，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)MEQ基因瞬時(shí)侵染對(duì)這些基因表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，在所檢測(cè)的基

7、因中，有7個(gè)表達(dá)量明顯上調(diào)，AGO10和HEN1基因的表達(dá)上調(diào)最為明顯，其次為MET1、NRPD2a、SGS3、AGO1a和DRM3基因。其中HEN1、MET1、NRPD2a、SGS3和DRM3基因與DNA甲基化有關(guān)，其余2個(gè)基因?qū)儆贏GO蛋白家族，是RNA沉默途徑的重要蛋白，由此推測(cè)，Meq基因可能通過(guò)影響AGO基因的表達(dá)介入RNA沉默途徑，同時(shí)對(duì)DNA的甲基化有影響，但二者之間是否存在聯(lián)系還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。
　　(4) M