法氏囊五肽的分離鑒定及其免疫調節(jié)和抗過氧化應激機理的研究.pdf

1、法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官,是B細胞分化發(fā)育和成熟的場所。法氏囊超濾液(1KDa以下)含有許多生物活性物質,特別是一些小肽不僅對禽類具有免疫調節(jié)功能,而且對哺乳動物及人類淋巴細胞也有明顯的免疫學及生理學活性。近年來,對法氏囊活性肽的研究雖然取得了一定的進展,但對法氏囊活性肽的認識還有很多空白,關于它們的生物學特性及功能等方面還有很多值得研究的地方。雖然,禽法氏囊在體液免疫中起調節(jié)作用,但還對細胞免疫反應的調節(jié)膀導效應具有重要的功能。

2、文獻所報道的法氏囊小肽如,囊素三肽(Lys-His-Gly-Amide)、法氏囊肽-1(Tyr-Glu—Glu)、法氏囊肽-2(Trp-Thr—Ala-Glu-Glu-Lys—Gln-Leu)及法氏裳七肽(BSP—Ⅱ,TPSGLVY)等,雖然都對B細胞或體液免疫產生影響,但它們各自也有不同的功能。事實上,代謝過程、免疫和神經內分泌系統(tǒng)之間有相互的作用,影響機體的生理動態(tài)平衡。因此,雖然從免疫學觀點研究法氏囊活性肽,了解其在禽法氏囊中的免

3、疫學特性是必需的,但對法氏囊活性肽的其他功能的研究同樣也是很重要的。由于法氏囊重要的免疫調節(jié)活性以及法氏囊提取物具有廣泛的生物學活性,因此,對法氏囊中新的活性物質的研究具有非常廣闊的領域和實際應用的廣泛意義,同時,對于深入了解法氏囊的免疫調節(jié)機理及其他生理功能具有重要的理論意義。
　　 本研究,充分利用當代先進的生物技術及分析手段,從雞的法氏囊中提取到一種新的活性五肽:法氏囊五肽(Bursopentine,BP5)。通過研究法氏

4、囊五肽聯(lián)合禽流感滅活疫苗免疫雞和小鼠來評價其免疫調節(jié)活性并對其免疫調節(jié)機理進行探討。另外,通過體外化學模擬的方法以及巨噬細胞氧化應激模型對其抗氧化活性和抗過氧化應激的機理展開了研究。本研究主要從以下幾個方面展開:
　　 1法氏囊五肽的分離、純化和鑒定
　　 法氏囊是禽類特有的免疫器官,是B細胞分化發(fā)育和成熟的場所,其提取物中含有多種活性物質,具有廣泛的生物學活性。本試驗以雞法氏囊為原料,通過勻漿、凍融、超濾和反相高效液相

5、色譜(RP-HPLC)等步驟,分離純化得到了一種新的活性肽:法氏囊五肽(Bursopentine)。從500 g新鮮的雞法氏囊組織中純化到了4.82 mg的法氏囊五肽。經Edman降解法和ESI-Q-TOF-MS質譜分析,獲得了完整的法氏囊五肽氨基酸序列:Cys—Lys-Asp-Val-Tyr,并測知其分子量為626.27 Da。
　　 2法氏囊五肽在雞體內的免疫學活性研究
　　 為探討法氏囊五肽的免疫調節(jié)活性,6周齡白

6、來航雞隨機分為5組,每組30只。用合成的法氏囊五肽(BP5)和H9N2禽流感滅活病毒(AIV)混合后分別以肌肉接種的方式給雞進行2次免疫,同時設兩組對照組雞,分別免疫PBS和滅活的H9N2 AIV。最后一次免疫后1周攻毒。然后通過測定血清 HI效價、Th1和 Th2類型細胞因子分泌水平、淋巴細胞增殖來評價BP5對機體免疫功能的影響。同時以攻毒保護力來評價BP5作為分子佐劑的免疫調節(jié)作用。實驗結果顯示,BP5能夠顯著提高機體的抗原特異性抗

7、體(HI抗體)；顯著提高AIV抗原免疫雞的細胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平；能有效促進AIV抗原免疫雞的血液淋巴細胞的增殖。雞攻毒后肺臟病毒含量檢測顯示,BP5有助于AIV抗原免疫雞肺臟病毒的清除。以上結果顯示BP5通過介導體液和細胞免疫反應,顯著提高了雞的抗原特異性免疫保護作用,證明其具有良好的免疫調節(jié)活性。
　　 3法氏囊五肽免疫調節(jié)機理的研究
　　 為了進一步研究法氏囊五肽的免疫調節(jié)機理,4-6周齡小鼠隨機分

8、為6組,每組30只。用不同劑量合成的法氏囊五肽(BP5)與H9N2禽流感滅活病毒(AIV)混合后分別以肌肉接種的方式給小鼠進行3次免疫,同時設兩組對照組小鼠,分別免疫PBS和常規(guī)滅活疫苗。實驗結果表明,BP5提高了特異性HA抗體(IgG抗體及其亞型IgG1和IgG2a)的水平,增強了Th1型(IL-2和干擾素-γ)和Th2型(IL-4和-10)細胞因子的分泌,促進了脾淋巴細胞亞群CD4+T細胞(CD3+CD4+)、CD8+T細胞(CD3

9、+CD8+)和B細胞的增殖,增強了細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對NIH3T3細胞的殺傷活性。進一步的研究表明,BP5具有直接激活B細胞而間接增加T細胞增殖的活性；而BP5誘導的B淋巴細胞增殖是由BP5本身巰基自氧化生成的活性氧介導的。此外,本試驗的數(shù)據還表明,BP5通過信號通路PKC,p38 MAPK和NF—κB發(fā)揮誘導B淋巴細胞增殖的作用。這項研究顯示,BP5或可作為一種新的強效免疫調節(jié)劑或免疫增強劑應用于藥物或疾病控制。
　　

10、 4法氏囊五肽體外抗氧化活性研究
　　 為了進一步了解法氏囊五肽的其它生理功能,在體外無細胞系統(tǒng),對其抗氧化功能進行了研究。由于法氏囊五肽是一種新的含巰基的活性肽,而很多含巰基的物質具有抗氧化作用,故法氏囊五肽在理論上存在抗氧化活性的可能。本研究應用體外化學模擬的方法證明了法氏囊五肽具有較強的抗氧化活性,包括較強的還原能力,很好的金屬螯合能力以及極強的清除自由基的活性,包括清除超氧自由基(O2-)和羥自由基(OH)的活性。實驗

11、證明,法氏囊五肽是一種天然的抗氧化劑,具有極好的開發(fā)應用前景。
　　 5法氏囊五肽抗過氧化應激活性及其機理的研究
　　 為了進一步驗證法氏囊五肽在活細胞中的抗過氧化活性,本實驗利用LPS誘導的活細胞過氧化應激模型對此展開了研究。在LPS激活的小鼠腹腔巨噬細胞中,BP5顯著地抑制了活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的產生,降低了脂質過氧化水平以及抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性。在活細胞中,BP5顯示了良好的抗過

12、氧化活性。為了探討B(tài)P5這種抑制細胞過氧化應激的機制,本試驗研究了BP5對細胞自由基清除系統(tǒng),特別是對谷胱甘肽(GSH)氧化還原循環(huán)及抗氧化酶系統(tǒng)進行了研究。實驗數(shù)據表明,BP5提升了細胞抗氧化還原保護狀態(tài),包括提高了細胞GSH含量以及提高了一些重要的酶系統(tǒng),其中包括谷胱甘肽過氧化酶,谷胱甘肽還原酶,超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等的活性。為了進一步了解BP5這種抑制氧化應激機制的基礎,本實驗研究了BP5對細胞核轉錄因子κB(NF-κB)水