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文檔簡介
1、本研究首次采用噬菌體抗體庫技術(shù)制備H-Y抗原的Fab抗體,利用雄鼠脾細(xì)胞作為抗原免疫同系雌鼠,構(gòu)建了表面表達(dá)Fab的鼠源性噬菌體抗體庫,并初步篩選出與雄鼠脾細(xì)胞特異性結(jié)合的Fab噬菌體克隆。首先,取雄鼠脾細(xì)胞免疫6~7周齡雌性C57BL/6雌鼠,加強(qiáng)免疫10天后,通過精子細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H-Y抗血清,取免疫效果較好的雌鼠脾細(xì)胞,Trizol法提取細(xì)胞總RNA,合成cDNA第一條鏈,利用簡并引物進(jìn)行PCR反應(yīng),擴(kuò)增出抗體的F
2、d基因和全長輕鏈基因,將輕鏈基因和重鏈Fd基因分別插入噬菌體表達(dá)載體pComb3,然后將重組噬質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌XL1-Blue中,分別構(gòu)建成κ鏈基因庫和抗體Fab段基因庫,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選,計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。通過PCR反應(yīng)和雙酶切反應(yīng)鑒定抗體庫的重組率,輕鏈、重鏈Fd段基因的重組率均為80﹪。抗體Fab段基因庫經(jīng)過輔助噬菌體VCSM13超感染,成功構(gòu)建了鼠源性噬菌體Fab抗體庫。經(jīng)測(cè)定,噬菌體抗體庫的庫容和滴度分別為5.2×106和3.2×
3、1011pfu/mL。利用雄鼠脾細(xì)胞對(duì)噬菌體抗體庫進(jìn)行3輪親和富集及2輪雌鼠脾細(xì)胞吸附交替篩選,特異性噬菌體得到有效的富集。從篩選后的噬菌體抗體庫感染的XL1-Blue培養(yǎng)菌落中隨機(jī)挑取15個(gè)菌落,鑒定含F(xiàn)ab基因克隆的重組率約為60﹪。ELISA檢測(cè)鼠源性噬菌體Fab抗體特異性,結(jié)果顯示有9株能與雄鼠脾細(xì)胞特異性結(jié)合,具有較好的雄性特異性。經(jīng)測(cè)序分析,E5克隆的重鏈、輕鏈可變區(qū)序列分別屬于VH1和VκⅣ基因家族。 以上結(jié)果表明
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