斑點叉尾鮰NLR家族幾個免疫相關基團的表達分析及染色體定位.pdf

1、NLRs(nucleotide-binding domain,leucine-rich repeat containing receptors)是病原識別受體家族(pathogen recognition receptors,PRRs)的重要成員,PRR通過感知與病原體相關的分子模式(pathogen-associated molecular pattems,PAMs)來識別入侵的病原體,它們在先天免疫中起著重要的作用。近年來,有學者對

2、斑點叉尾鮰(Ictalurus Punctatus)NLR-A亞家族(NOD)基因(包括NOD1、NOD2、NLRC3、NLRC5和NLRX1)進行了克隆和特征分析,并研究了愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)誘導下各個基因的表達情況,然而在斑點叉尾鮰的養(yǎng)殖實踐中除了愛德華氏菌外,還有多種病原都給斑點叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的損失,本文選取了最具代表性的幾種細菌和病毒——遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatard

3、a)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鏈球菌(Streptococcus iniae)和斑點叉尾鮰呼腸孤病毒(Channel Catfish Hemorrhage Reovirus,CCRV)分別對斑點叉尾鮰進行感染實驗,通過實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法檢測了NOD亞家族中各個基因在健康的斑點叉尾鮰的12種不同組織中以及在感染幾種病原后的肝臟、脾臟、

4、腸和頭腎中的時空表達特征,探討它們與斑點叉尾鮰先天免疫反應的關系。同時,本文還通過熒光原位雜交技術對NOD1和NOD2兩個重要基因進行了染色體定位研究,以便從染色體水平更加直觀的進一步了解這些基因,為將來對NODs基因的深入研究打下基礎。此外,本文還對斑點叉尾鮰BIRC7基因進行了克隆和表達分析,首先用RACE方法克隆了斑點叉尾鮰BIRC7基因(CcBIRC7),并用qRT-PCR技術檢測了該基因在不同組織中以及在分別感染遲鈍愛德華氏菌

5、、鏈球菌和斑點叉尾鮰呼腸孤病毒后在頭。腎、肝臟和脾臟中的表達情況。本研究的主要結果如下:
　　1.斑點叉尾鮰NODs基因在細菌和病毒感染后的表達特征
　　所有的NODs基因在健康魚體的12種組織中(臟、脾臟、腸、頭腎、血、后腎、胃、心臟、腦、鰓、肌肉和皮膚)持續(xù)而廣泛的表達,其中在血、肌肉、鰓、心臟中的表達量較高。除了在感染嗜水氣單胞菌和斑點叉尾鲴呼腸孤病毒后在脾臟中的表達與對照組相比呈現(xiàn)下調(diào)外,感染所有的四種病原后,NOD

6、1,NOD2,NLRC3,NLRC5在腸、肝臟和頭腎中都表現(xiàn)為大幅度的上調(diào)表達。NLRX1的表達在腸、肝臟和頭腎中上升而在脾臟中下降。在四種不同的病原中,革蘭氏陽性菌鏈球菌最能引起NODs各基因的上調(diào)表達,且上升幅度最大,而斑點叉尾鮰呼腸孤病毒只能引起輕微的上調(diào)表達。從不同的組織來看,NODs在肝臟中的表達變化最大,其次是頭。腎,腸,最后是脾臟。將NOD亞家族的五種基因進行比較,結果發(fā)現(xiàn)NOD2的表達上調(diào)最為強烈,而NLRX1相對來說變

7、化幅度不大。所有的這些數(shù)據(jù)都說明,NODs在參與斑點叉尾鮰先天免疫反應過程中表現(xiàn)出了明顯的組織特異性和病原特異性,同時各基因在受到細菌和病毒誘導后有著相似的表達模式,表明了它們在抗細菌和病毒過程中具有協(xié)同作用,為NODs基因在斑點叉尾鮰先天免疫中的重要性增添了有力的證據(jù)。
　　2.斑點叉尾鮰BIRC7的克隆和感染不同病原后的表達分析
　　斑點叉尾鮰BIRC7基因(CcBIRC7)cDNA序列全長1686 bp(GenBank

8、登錄號為JQ268267),包括1194 bp開放閱讀框,93 bp5'非翻譯區(qū)以及含poly(A)信號的399 bp的3'非翻譯區(qū),編碼398個氨基酸。CcBIRC7基因包含有兩個BIR(baculoviral IAP repeats)保守結構域和一個指環(huán)結構。氨基酸序列同源性分析表明,CcBIRC7基因推測的氨基酸序列與羅非魚、斑馬魚BIRC7氨基酸序列的同源性分別為68.0％和62.3％,與其他物種的BIRC7氨基酸序列的同源性為

9、38％-50％,表現(xiàn)為中度保守。qRT-PCR分析結果表明,CcBIRC7基因廣泛表達于健康斑點叉尾鮰的12種不同組織中,其中在血液中的表達量最高。遲鈍愛德華氏菌和鏈球菌都能顯著誘導CcBIRC7基因的表達,與細菌相比,斑點叉尾鮰呼腸孤病毒對CcBIRC7基因的誘導作用較為微弱,在脾臟中甚至抑制了該基因的表達。從表達結果中可以看出,BIRC7基因在斑點叉尾鮰的先天免疫系統(tǒng)中特別是在抵御細菌入侵方面發(fā)揮了重要的作用,關于BIRC7基因在魚