斑點(diǎn)叉尾鮰抗病免疫相關(guān)microRNA的發(fā)掘及功能預(yù)測(cè).pdf

1、MicroRNA（miRNA）是一類在動(dòng)植物體中廣泛存在的內(nèi)源性非編碼小RNA分子。miRNA主要參與基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控，在生物體發(fā)育、細(xì)胞活動(dòng)、免疫功能調(diào)控及疾病發(fā)生等許多生命活動(dòng)過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。人和動(dòng)物miRNA的研究報(bào)道較多，且日漸深入；魚類作為重要的脊椎動(dòng)物，其miRNA的研究報(bào)道較少，尤其miRNA在抗病免疫調(diào)控功能方面的研究更少。為了研究魚類miRNA在免疫調(diào)控中的作用，本論文以在硬骨魚類免疫系統(tǒng)中具有較高代表性

2、的斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，首先研究了免疫刺激劑脂多糖（LPS）及β-葡聚糖處理下斑點(diǎn)叉尾鮰免疫組織中9個(gè)免疫相關(guān)miRNA及6個(gè)細(xì)胞因子的表達(dá)變化；在此基礎(chǔ)上，通過二代高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了擬態(tài)弧菌感染前后斑點(diǎn)叉尾鮰免疫組織中miRNA表達(dá)譜，并對(duì)差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)。研究結(jié)果不僅對(duì)深入了解miRNA的抗病免疫調(diào)控功能具有參考價(jià)值，并為后續(xù)miRNA功能研究奠定良好基礎(chǔ)。

3、本論文實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分：
　　一、LPS和β-葡聚糖免疫刺激下斑點(diǎn)叉尾鮰免疫相關(guān)miRNA及細(xì)胞因子表達(dá)差異
　　選取平均體重為18.48±0.20 g的斑點(diǎn)叉尾鮰40尾，隨機(jī)分成兩組，分別腹腔注射PBS溶液和LPS溶液（5 mg/ml）0.1 ml/尾，24 h后采集斑點(diǎn)叉尾鮰主要免疫器官肝臟、頭腎、脾臟樣品；選取平均體重為2.20±0.02 g的斑點(diǎn)叉尾鮰240尾，隨機(jī)分成兩組，分別投喂基礎(chǔ)飼料及添加β-葡聚糖（1 g/

4、kg）的基礎(chǔ)飼料，進(jìn)行為期30天的投喂實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)后采集斑點(diǎn)叉尾鮰主要免疫器官肝臟、頭腎、脾臟樣品。將采集的斑點(diǎn)叉尾鮰主要免疫器官肝臟、頭腎、脾臟樣品，液氮速凍，提取總 RNA，反轉(zhuǎn)錄之后通過熒光定量PCR對(duì)三個(gè)組織中的9個(gè)已知的免疫相關(guān)miRNA及6個(gè)免疫相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行研究。結(jié)果表明，9個(gè)免疫相關(guān) miRNA在肝臟、頭腎、脾臟一個(gè)或幾個(gè)組織中差異表達(dá)顯著，且主要是表達(dá)上調(diào)，但LPS處理引起的miRNA的表達(dá)變化更大。6個(gè)細(xì)胞因子在肝

5、臟、頭腎、脾臟一個(gè)或幾個(gè)組織中都差異表達(dá)，β-葡聚糖刺激引起的表達(dá)主要是下調(diào)的，而LPS引起的表達(dá)主要呈上調(diào)的。
　　二、擬態(tài)弧菌感染前后斑點(diǎn)叉尾鮰miRNA表達(dá)譜構(gòu)建及靶基因分析
　　選取平均體重為170.08±23.75 g的斑點(diǎn)叉尾鮰80尾，隨機(jī)分成兩組，分別腹腔注射PBS溶液和擬態(tài)弧菌菌液（6.78×107個(gè)/ml）0.1 ml/尾，48 h后采集頭腎、脾臟組織樣品液氮速凍，-80℃保存。對(duì)樣品分別提取總RNA，檢測(cè)

6、質(zhì)量合格后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后通過Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)及生物信息學(xué)分析，構(gòu)建了斑點(diǎn)叉尾鮰擬態(tài)弧菌感染前后頭腎、脾臟組織的四個(gè)cDNA文庫(kù)。以近緣物種墨西哥脂鯉（Astyanaxmexicanus）基因組為參考基因組，對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行分類注釋，并與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的全部動(dòng)物已知miRNA進(jìn)行比對(duì)，在感染前后頭腎組織中分別鑒定了1504和1658個(gè)保守的miRNA及25和27個(gè)新miRNA；在感染前后的脾臟組織中分別鑒定了

7、1407和1258個(gè)保守的miRNA及23和15個(gè)新miRNA。通過expdiff方法對(duì)感染前后miRNA表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬態(tài)弧菌感染導(dǎo)致頭腎中502個(gè)保守的和10個(gè)新的miRNA差異表達(dá)；而在脾臟組織中有281個(gè)保守的和6個(gè)新的miRNA差異表達(dá)。我們對(duì)這些差異表達(dá)的保守miRNA及新的miRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)分析，并對(duì)獲得的靶基因進(jìn)行了功能分類富集和代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)靶基因富集在抗病免疫相關(guān)的通路中。
　　結(jié)論