外源dsRNA抗甘蔗花葉病毒干擾調(diào)控研究.pdf

1、玉米（Zea mays L.）是重要的糧食作物與飼料作物，也是現(xiàn)代蔬菜、食品、醫(yī)藥與化學(xué)工業(yè)的重要原料。然而，玉米病害尤其是玉米矮花葉病成了限制我國(guó)玉米產(chǎn)量與質(zhì)量的重要因素。傳統(tǒng)的育種方法由于抗性資源的匱乏及物種間的遺傳隔離，使抗病育種工作受到了極大的限制。利用基因工程技術(shù)對(duì)玉米進(jìn)行遺傳改良，以增強(qiáng)玉米抗病蟲(chóng)與耐逆境能力，提高產(chǎn)量，改善品質(zhì)，這成為玉米遺傳育種的一個(gè)新方向。植物抗病毒基因工程的策略有多種，研究表明利用RNAi 原理介導(dǎo)的

2、抗病性特異性強(qiáng)，比較容易獲得高抗甚至免疫的轉(zhuǎn)基因植株，為作物抗病毒基因工程提供了更有效的途徑。本文利用RT-PCR擴(kuò)增甘蔗花葉病毒cp基因特異性干涉片段，構(gòu)建原核表達(dá)載體LMCP，利用IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用細(xì)菌表達(dá)的dsRNA提取液處理玉米植株，分析外源dsRNA 抗SCMV的效果。結(jié)果表明：
　　 1、根據(jù)甘蔗花葉病毒cp基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增甘蔗花葉病毒cp基因上游及下游147 bp

3、和140 bp的干涉片段。
　　 2、利用pUCCRNAi 克隆載體構(gòu)建甘蔗花葉病毒cp基因反向重復(fù)序列克隆載體pUCCRNAi+2 F，再插入到原核表達(dá)載體L4440中，構(gòu)建原核表達(dá)載體LMCP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HT115。
　　 3、利用IPTG 誘導(dǎo)并對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，LMCP在大腸桿菌HT115(DE3)菌株中可表達(dá)產(chǎn)生預(yù)期大小的dsRNA 片段。而且當(dāng)IPTG 濃度為0.4~0.6 mmol/L，誘導(dǎo)4

4、 h 左右時(shí)表達(dá)量最高。
　　 4、利用不同細(xì)菌表達(dá)的dsRNA 提取液噴灑4 葉期玉米植株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LMCP1dsRNA 及LMCP2 dsRNA 對(duì)甘蔗花葉病毒的干涉效果明顯，而且LMCP1dsRNA的處理效果較LMCP2的好。
　　 5、通過(guò)對(duì)dsRNA的處理濃度、接種病毒的時(shí)間（持效期）、滲透性等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，外源dsRNA 提取液對(duì)甘蔗花葉病毒具有免疫作用，當(dāng)dsRNA稀釋1/5以內(nèi)時(shí)，對(duì)病毒侵染的