RNAi調(diào)控玉米抗甘蔗花葉病毒和粗縮病毒的研究.pdf

1、玉米是重要的糧食、飼料與工業(yè)原料作物。目前我國玉米的種植面積呈逐年增加的趨勢，但玉米病害尤其是玉米的矮花葉病和粗縮病成了限制我國玉米生產(chǎn)發(fā)展的巨大障礙，造成玉米的大量減產(chǎn)和品質(zhì)下降。利用基因工程技術(shù)培育推廣抗病品種和尋找新方法已成為病毒病防治的迫切需求。RNA干涉作為一種特異、高效的反向遺傳學(xué)手段，在植物的抗病毒育種中表現(xiàn)出了巨大的優(yōu)勢，成為植物抗病毒基因工程的熱點(diǎn)。為進(jìn)～步篩選和建立病毒cp基因dsRNA的原核表達(dá)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系，

2、探討RNAi技術(shù)在玉米抗病毒基因工程中的應(yīng)用效果，建立玉米R(shí)NAi的分子育種新方法。本文利用大腸桿菌HT115高效表達(dá)甘蔗花葉病毒cp基因dsRNA，較系統(tǒng)地研究了外源dsRNA抗甘蔗花葉病毒RNAi調(diào)控技術(shù)；構(gòu)建了兼抗甘蔗花葉病毒及粗縮病毒cp基因的RNAi復(fù)合表達(dá)載體，開展農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米原位轉(zhuǎn)化，并對(duì)轉(zhuǎn)化株進(jìn)行了分子確證，在此基礎(chǔ)上對(duì)轉(zhuǎn)化株RaNAi效果和抗病性進(jìn)行了分析，獲得了如下主要結(jié)果：
　　 l、根據(jù)甘蔗花葉病毒c

3、p基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，RT-PCR擴(kuò)增甘蔗花葉病毒cp基因特異性干涉片段，構(gòu)建cp基因反向重復(fù)原核表達(dá)載體LMCP。利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，LMCP在大腸桿菌HT115(DE3)菌株中可表達(dá)產(chǎn)生預(yù)期大小的片段，經(jīng)DNaseⅠ和RNase A消化處理，證實(shí)為dsRNA。同時(shí)IPTG濃度為0.4～0.6mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)4 h，dsRNA的表達(dá)量最高。
　　 2、利用大腸

4、桿菌表達(dá)的dsRNA提取液處理玉米8112植株，并對(duì)處理參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)dsRNA稀釋1/5濃度以下時(shí)處理效果明顯；dsRNA噴灑后3 d內(nèi)接種病毒，抗病毒侵染效果最好；另外，加入適宜濃度的滲透劑能提高dsRNA的抗病效果。
　　 3、RT-PCR分別擴(kuò)增甘蔗花葉病毒和粗縮病毒外殼蛋白基因特異性RNA干擾片段，分別構(gòu)建成反向重復(fù)序列并串聯(lián)在一起，再與抗除草劑bar基因分別插入到pDTBU的兩個(gè)T-DNA區(qū)段，構(gòu)建了兼抗

5、甘蔗花葉病毒和粗縮病毒的RNA干涉復(fù)合表達(dá)載體pDTBU SM。并通過凍融法將該載體直接導(dǎo)入農(nóng)桿菌，獲得了經(jīng)PCR鑒定的轉(zhuǎn)化子，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米原位轉(zhuǎn)化。
　　 4、利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的原位轉(zhuǎn)化技術(shù)將cp基因RNA干涉表達(dá)載體pDTBU SM轉(zhuǎn)入玉米8112自交系，對(duì)T0代植株進(jìn)行除草劑Basta篩選，結(jié)合PCR擴(kuò)增篩選得到19株共轉(zhuǎn)化植株，對(duì)T1代共轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行PCR檢測及Southern雜交分析，證明有3個(gè)株系發(fā)生了分離，且

6、獲得了整合有cp基因。RNAi片段的轉(zhuǎn)化株。
　　 5、提取T1代不同轉(zhuǎn)化株的葉片總RNA以及開花期不同器官的RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，進(jìn)行熒光定量檢測cp基因在不同轉(zhuǎn)基因植株以及在同一轉(zhuǎn)基因植株不同器官中的表達(dá)量，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的cp基因干涉片段在不同轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量不同。目的基因在雄花和葉中的表達(dá)量最高，而在根中的表達(dá)量最低。
　　 6、T2代轉(zhuǎn)基因玉米植株4葉期時(shí)接種甘蔗花葉病毒，并于接毒后不同時(shí)間提取葉片總RNA

7、，熒光定量檢測外源病毒誘導(dǎo)對(duì)內(nèi)源cp基因表達(dá)的影響，結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的cp基因干涉片段對(duì)甘蔗花葉病毒產(chǎn)生了干涉效應(yīng)，轉(zhuǎn)入的cp基因RNAi片段在轉(zhuǎn)基因植株中能正確轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致cp基因mRNA含量的交替變化。
　　 7、對(duì)T2代4葉期轉(zhuǎn)基因玉米接種甘蔗花葉病毒，于接毒后14 d、21 d、30 d取葉片，ELISA檢測植株的發(fā)病情況，結(jié)果表明，不同轉(zhuǎn)化株株系的感病情況有差異，但抗病性均不同程度地高于對(duì)照。
　　 綜上所述，本文