海豚鏈球菌(Strepstococcus iniae)胞外產(chǎn)物的特性及其對牙鲆的免疫效應(yīng).pdf

1、作為重要的水產(chǎn)動(dòng)物致病菌,鏈球菌可感染多種野生及養(yǎng)殖魚類并導(dǎo)致大規(guī)模死亡,但對于其毒力相關(guān)與免疫相關(guān)的關(guān)鍵性蛋白仍知之甚少。本文即選取9株魚源鏈球菌,其中包括5株海豚鏈球菌(Strepstococcus iniae)NUF849、NUF812、NUF701、NUF693和NUF633以及4株停乳鏈球菌(Strepstococcus dyssgalactiae)SD、L2、WZ和HT,將胞外產(chǎn)物作為研究對象,通過對菌株代謝能力、不同菌株胞

2、外產(chǎn)物的蛋白組成及抗原性、同一菌株不同培養(yǎng)條件下胞外產(chǎn)物的蛋白組成及抗原性進(jìn)行比較,分析了胞外產(chǎn)物的特性,并對牙鲆進(jìn)行免疫與攻毒(Paralichthys olivaceus)驗(yàn)證了胞外產(chǎn)物的免疫效應(yīng)。具體方法結(jié)果如下:
　　 (1)對9株鏈球菌的生理生化特性進(jìn)行了分析、比較,利用Rapid STREP32E鑒定試劑條探究了菌株對有機(jī)物的代謝能力,利用哥倫比亞綿羊血平板驗(yàn)證了菌株的溶血特性。結(jié)果顯示,9株菌的生理生化特性各異,分

3、泌的代謝酶組成不同;分布有3種溶血類型,即α、β和γ。測算了各菌株對牙鲆的半數(shù)致死量、確定了菌株的致病性,其中NUF849毒力最強(qiáng)。這些結(jié)果從代謝角度體現(xiàn)了9株菌胞外產(chǎn)物組成上的差異,同時(shí)說明所選菌株能夠代表不同種屬、不同毒力、不同溶血類型及不同代謝能力的鏈球菌。
　　 (2)以強(qiáng)毒株海豚鏈球菌NUF849為例,從培養(yǎng)時(shí)間與濃縮方法兩方面優(yōu)化了鏈球菌胞外產(chǎn)物的制備方法,即利用平板玻璃紙法培養(yǎng)細(xì)菌60 h獲得胞外產(chǎn)物后,直接透析除

4、鹽并予以凍干。此法制得的胞外產(chǎn)物多樣性保持良好。
　　 (3)提取了9株鏈球菌的胞外產(chǎn)物,用SDS-PAGE比較分析其蛋白條帶組成、Western-blot比較分析其抗原性。結(jié)果表明不同種屬、不同來源、不同毒力的菌株所產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物不同,表現(xiàn)為條帶分子量與豐度的差異。同一物種的細(xì)菌胞外產(chǎn)物圖譜相近;同一物種、毒力相當(dāng)?shù)珌碓床煌木耆鏢D和L2圖譜也不同;毒力較強(qiáng)的菌株條帶較豐富,如毒力較強(qiáng)的NUF849、NUF812與NUF6

5、93均有一條分子量約為37 kDa的條帶,而毒力較弱的NUF701和NUF633圖譜中此條帶不明顯。菌株間共有條帶主要有14、20、25、27、30、38、45、47、50和60kDa等。
　　 胞外產(chǎn)物具有良好抗原性,可為感染NUF849后存活的牙鲆血清所識別,除停乳鏈球菌WZ反應(yīng)較弱以外,其他菌株間均存在強(qiáng)烈的交叉反應(yīng)。菌株間具有多條共有抗原條帶,除WZ外的8株菌所共有的條帶為27、45、60 kDa等。弱毒株NUF693與

6、NUF633有一分子量約為60 kDa的條帶,能夠與陰性血清發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng),而其他菌株、其他條帶與陰性血清反應(yīng)較弱或無反應(yīng)。
　　 (4)選取毒力最強(qiáng)、胞外產(chǎn)物條帶豐富的海豚鏈球菌NUF849,將其置于不同溫度、鹽度、葡萄糖含量、鐵元素含量、氣體等環(huán)境條件下進(jìn)行培養(yǎng),測定24 h生長曲線同時(shí)制備其胞外產(chǎn)物進(jìn)行條帶組成與抗原性的比較,以進(jìn)一步分析胞外產(chǎn)物的特性。結(jié)果證實(shí)NUF849胞外產(chǎn)物的分泌受環(huán)境調(diào)控影響,蛋白組成圖譜發(fā)生變化,

7、且變動(dòng)的條帶具有抗原性。對環(huán)境變化敏感且具有抗原性的蛋白條帶主要有25、27、37、42、45和60 kDa。這些條帶可以作為亞單位疫苗的備選成分。不同的環(huán)境條件下,細(xì)菌的生長狀態(tài)也發(fā)生變化。最適宜NUF849生長繁殖的環(huán)境條件組合為:28℃,在鹽度(NaCl含量)和葡萄糖含量均為5‰的培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng),可酌量添加動(dòng)物血清以促進(jìn)生長。
　　 (5)最后分別以海豚鏈球菌NUF849的福爾馬林滅活全菌(FKC)、胞外產(chǎn)物(ECPs)

8、及二者的混合物(FKC+ECPs)免疫牙鲆,分別于免疫前,免疫后和免疫再攻毒后進(jìn)行取樣,驗(yàn)證胞外產(chǎn)物的免疫效應(yīng)。結(jié)果證實(shí)胞外產(chǎn)物本身具有交叉保護(hù)效果,而且可以輔助滅活全菌刺激牙鲆產(chǎn)生更高水平的免疫應(yīng)答:FKC+ECPs可誘發(fā)更高的血清抗體水平,包括分別抗FKC和ECPs的兩種抗體;可顯著提高血細(xì)胞吞噬能力(P＜0.05);FKC+ECPs組血清中SOD、POD及ACP的活力也體現(xiàn)出較高的免疫應(yīng)答水平;攻毒實(shí)驗(yàn)中,FKC、ECPs和FKC

9、+ECPs三組對同源菌株NUF849的相對免疫保護(hù)率分別為50％、40％和90％,對異源菌株NUF812的相對免疫保護(hù)率分別為60％、30％和80％,FKC+ECPs組顯著高于其他組(P＜0.05)。另外,免疫再攻毒后的數(shù)據(jù)能更為直觀的體現(xiàn)出FKC+ECPs組的優(yōu)勢。
　　 利用攻毒后存活的牙鲆血清分析NUF849及NUF812的抗原性,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩株菌的超聲破碎全菌和胞外產(chǎn)物中均包含良好抗原,胞外產(chǎn)物中抗原更為豐富。破碎全菌中發(fā)

10、生反應(yīng)的條帶分布于25-100 kDa,胞外產(chǎn)物中發(fā)生反應(yīng)的條帶分子量則分布于18-100 kDa。胞外產(chǎn)物中,NUF849和NUF812主要的共有抗原條帶為37、45和60 kDa。
　　 綜合上述結(jié)果,可以確定海豚鏈球菌NUF849的胞外產(chǎn)物中存在保護(hù)性抗原以及在致病過程中起重要作用的蛋白。這些蛋白的分子量有可能為25、27、37、42、45和60 kDa。本文可為從鏈球菌胞外產(chǎn)物中篩選關(guān)鍵性蛋白、研制具有交叉保護(hù)效果的高效