兩株攜帶豬流行性腹瀉病毒S蛋白抗原區(qū)域的減毒沙門氏菌的構建與免疫規(guī)律研究.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的以嘔吐、腹瀉、脫水和哺乳仔豬高致病率、高死亡率為主要特征的一種接觸性腸道傳染病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。PEDV的S蛋白是誘導產(chǎn)生保護性中和抗體的結構蛋白。本研究進行了S蛋白抗原區(qū)域的篩選，分別構建了攜帶PEDV S蛋白主要抗原區(qū)域S499-650和S499

2、-789區(qū)域的重組減毒沙門氏菌疫苗，并以小鼠和仔豬為模型進行了口服免疫規(guī)律研究。
　　1.S基因的兩種真核表達載體的構建與鑒定
　　根據(jù)GenBank中PEDV SC-L株S基因序列，設計特異性引物，采用RT-PCR技術擴增并克隆了S499-650、S499-789基因，并分別將S499-650、S499-789基因插入真核表達質(zhì)粒pVAX1中，構建重組真核表達質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789，然后

3、轉染COS-7細胞，通過間接免疫熒光及Western-blotting進行了蛋白表達鑒定，重組真核表達質(zhì)?？稍贑OS-7細胞中表達目的蛋白，表達的蛋白可與兔抗PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應，證明真核表達載體構建成功。
　　2.兩株攜帶S基因的重組減毒沙門氏菌的構建及生物學特性研究
　　將真核表達質(zhì)粒pVAX-S499-650、pVAX-S499-789分別電轉化入減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207，構建了重組減毒沙門氏菌菌株SL

4、7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)。將這兩株重組菌株分別以1×109 CFU/只劑量口服免疫小鼠，對重組菌株在小鼠體內(nèi)的穩(wěn)定性、攜帶目的基因在體內(nèi)的轉錄、小鼠體內(nèi)的增殖、對小鼠的安全性等菌株生物學特性進行研究。結果表明，SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)兩株口服菌株均具有較高的穩(wěn)定性;攜帶的目的基因可在腸道組織內(nèi)轉錄;重組菌在小鼠肝、脾中

5、增殖約5周后逐漸被機體清除;重組菌株對小鼠具有良好的安全性。本研究結果表明減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207可作為PEDV S基因不同抗原片段的呈遞載體，為后續(xù)開展兩種菌株的豬體口服免疫效果比較研究奠定了基礎。
　　3.重組減毒沙門氏菌的口服免疫原性研究
　　將15頭仔豬，分成5組，分別以1×1012 CFU/頭劑量口服免疫重組菌株SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)，同時設PE

6、DV滅活苗陽性對照免疫組和SL7207(pVAX)、PBS陰性對照免疫組，兩周后加強免疫一次。在首免第0、2、4、6周采集免疫仔豬血清樣品及黏膜樣品，測定血清IgG與腸道黏膜抗體IgA的動態(tài)規(guī)律與中和活性、血清細胞因子IFN-γ、血清IL-4，外周血T淋巴細胞增殖實驗。結果顯示:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)可誘導產(chǎn)生一定水平的血清IgG、黏膜IgA，且抗體具有良好的病毒中和活性，

7、其中，口服疫苗誘導體液IgG的能力不如滅活苗，但誘導黏膜IgA的能力優(yōu)于滅活苗;外周血T淋巴細胞增殖實驗則表明SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)具有良好的免疫原性，可有效刺激T淋巴細胞的增殖;血清中細胞因子測定顯示:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)可激發(fā)IFN-γ的分泌，但對IL-4的分泌無明顯刺激作用，表明二株口服疫苗菌株主要誘導