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1、牛瑟氏泰勒蟲(chóng)(T.sergenti)p33蛋白是T.sergenti主要蟲(chóng)體表面蛋白之一,具有很好的反應(yīng)原性和免疫原性。本試驗(yàn)應(yīng)用的抗原是在E.coliDH5α表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)的韓國(guó)株T.sergenti(韓國(guó)株與中國(guó)株的T.sergenti氨基酸序列的同源性為99.6%)p33融合蛋白。經(jīng)Westernblot分析,韓國(guó)株T.sergenti的p33蛋白和p33融合蛋白與中國(guó)牛血清中T.sergentip33抗體具有良好的特異性反應(yīng),
2、而空表達(dá)載體MBP蛋白則不能。因此,韓國(guó)株T.sergentip33融合蛋白可以用于檢測(cè)中國(guó)株T.sergentip33抗體間接ELISA方法的診斷抗原。 對(duì)間接ELISA的反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索,確定了最適工作條件。結(jié)果表明,Nunc公司生產(chǎn)的酶標(biāo)板的變異系數(shù)為4.2%,達(dá)到間接ELISA的要求;p33融合蛋白抗原最適包被濃度為1.5μg/ml,最適包被條件為4℃12h;待檢血清的最適稀釋度為1:100,酶標(biāo)二抗的最適工作濃度為
3、1:4000,血清與酶標(biāo)二抗的反應(yīng)時(shí)間均為4℃1h;選用3%脫脂乳作為酶標(biāo)板的最適封閉液,最適封閉時(shí)間為37℃1h;PBST稀釋液中脫脂乳蛋白穩(wěn)定劑的濃度為3%;底物最適反應(yīng)條件為室溫25min;陰陽(yáng)性臨界值為0.35。經(jīng)阻斷試驗(yàn)、交叉反應(yīng)試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn),表明建立的間接ELISA方法是特異的,且重復(fù)性好;與乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)進(jìn)行比較,陰性符合率為90.0%,陽(yáng)性符合率為100%,總符合率為96.7%,P>0.05,說(shuō)明兩種檢測(cè)方法
4、無(wú)顯著性差異;對(duì)采集于延邊州牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病流行地區(qū)的琿春市、敦化市的104份牛血清樣品進(jìn)行間接ELISA檢測(cè),結(jié)果琿春市56份牛血清樣品的T.sergenti陽(yáng)性率為73.2%;敦化市48份牛血清樣品的T.sergenti陽(yáng)性率為60.4%。 本試驗(yàn)在國(guó)內(nèi)首次應(yīng)用韓國(guó)株T.sergentip33融合蛋白為抗原,成功建立了一種檢測(cè)中國(guó)牛血清中T.sergentip33抗體的間接ELISA診斷方法,為我國(guó)牛瑟氏泰勒蟲(chóng)病的免疫監(jiān)測(cè)和
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