JSRV檢測及JSRV轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)基因LTR致瘤機制相關(guān)性研究.pdf

1、綿羊肺腺瘤?。╫vine pulmonary adenomatosis，OPA）是一種綿羊肺腺瘤病病毒（jaagsiekte sheep retrovirus，JSRV）導致的肺腺泡樣腫瘤性疾病，病原JSRV為β—反轉(zhuǎn)錄病毒，國際獸疫局（OIE）將該病列為B類傳染病。在國內(nèi)，該病目前主要依靠常規(guī)病理學方法檢測診斷，嚴重障礙了我國OPA的快速診斷和防控，同時，對綿羊肺腺瘤病的發(fā)病機理尚有很多不清楚的地方。為了進一步研究JSRV的致病機制及

2、建立快速診斷OPA的方法，本研究在綿羊肺腺瘤病流行病學，病理學研究的基礎(chǔ)上，以獲得的3株抗JSRV—CA蛋白的單克隆細胞分泌的McAb為一抗，應用Western blot進行肽探針掃描，以鑒定三株單抗識別的線性表位；并應用非競爭性ELISA法測定三株單抗的功能性親和常數(shù)，篩選合適的單抗，用于建立基于JSRV—CA的血清學診斷法。以陽性標準病料與健康陰性羊肺組織為樣本，比較陰性、陽性樣本對JSRV—CA重組蛋白與抗JSRV—CA單抗的阻斷

3、率的差異，首次在國內(nèi)建立了綿羊肺腺瘤病的阻斷ELISA方法，并對該方法的特異性及臨床應用作了檢測。 同時，應用生物學軟件ClustaIW（1.8）對內(nèi)源性JSRV（enjSRV）與外源性JSRV（exjSRV）進行序列對比，針對兩者差異顯著的LTRU3區(qū)設計了特異性引物，在國內(nèi)首次建立了特異性PCR及套式PCR檢測exjSRV的方法。在700ng健康羊基因組DNA的背景下，梯度稀釋陽性質(zhì)粒pJSRV LTR為參照，對兩種PCR方

4、法的敏感性進行比較，并以建立的方法對臨床病料進行檢測。為研究JSRV轉(zhuǎn)錄起始/調(diào)節(jié)基因（LTR）與病毒致瘤機制的相關(guān)性，需高純度、高活力的肺泡Ⅱ型上皮細胞及enjSRV/exjSRV LTR作為研究材料。本研究采用IgG黏附法結(jié)合磁化樹脂微粒法分離并純化了山羊肺泡Ⅱ型上皮細胞，并應用堿性磷酸酶（AKP）結(jié)合核固紅染色鑒定細胞的純度，應用臺盼藍檢測細胞的活力。此外，克隆了JSRV的內(nèi)外源性LTR，并對其結(jié)構(gòu)進行了分析。用生物學軟件DNAs

5、tar，MatInspector比較了LTR U3區(qū)的同源性及細胞轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的差異，并基于U3區(qū)的核苷酸序列，用生物學軟件Mega繪制了JSRV LTR系統(tǒng)遺傳進化樹。在獲得了肺泡Ⅱ型上皮細胞及enJSRV/exJSRV LTR的基礎(chǔ)上，應用雙螢光素酶報告基因技術(shù)，比較了綿羊，山羊enJSRV LTR與綿羊exJSRVLTR在不同細胞內(nèi)的啟動子活性。此外，分別缺失突變了LTR的Gfi—Ⅰ、C/EBP、HNF—3β等三個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合

6、位點，比較了綿羊exJSRV LTR與突變后exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)啟動子活性的差異。實驗結(jié)果為：（1）本研究建立的ELISA法以阻斷率為37％作為陰性與陽性判斷的臨界點，可以明確區(qū)分感染JSRV的陽性病料與健康陰性對照。所建立的PCR檢測方法中，套式法的敏感性是一步法的10倍以上，可檢測出樣本中1～10拷貝的JSRV，同步檢測結(jié)果表明，以上的血清學和PCR檢測方法與臨床病理組織學診斷的結(jié)果高度一致。（2）本研究分離純化

7、的肺泡Ⅱ型上皮細胞純度為90％以上（AKP染色法），活細胞為95％以上（臺盼藍染色法）。（3）將本研究克隆測序的enJSRV/exJSRV LTR與GenBank上發(fā)表的其它JSRV LTR序列進行了系統(tǒng)遺傳進化樹分析，表明本研究克隆的enJSRV/exJSRV LTR分支明顯，且現(xiàn)有的enJSRV/exJSRV LTR在病毒與宿主共進化的過程中分別演化出2個不同的分支。本研究克隆的我國內(nèi)蒙古地區(qū)JSRV流行株與歐美毒株有較近的親緣關(guān)系

8、。（4）雙熒光素酶分析試驗表明，除肺泡Ⅱ型上皮細胞外，enJSRV/exJSRV LTR在各細胞內(nèi)的啟動子活性差異較小，而exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)相對活性為其他細胞內(nèi)相對活性的24—230倍。分別缺失突變C/EBP、HNF—3β轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的綿羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)的啟動子活性下降約60％—70％。 以上結(jié)果表明：JSRV病毒粒子及exJSRV序列在肺腫瘤組織中含量高，是臨床實驗室檢測的理

9、想材料，而外周血白細胞中亦含有exJSRV序列，需用高敏感的套式PCR作檢測。exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)表現(xiàn)出高活性，說明綿羊exJSRV LTR對肺泡Ⅱ型上皮細胞具有特殊嗜性。此外，缺失轉(zhuǎn)錄因子C/EBP、HNF—3β結(jié)合位點顯著影響綿羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)的啟動子活性，說明這兩個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點對綿羊exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮細胞內(nèi)的特殊嗜性具有重要作用。本研究建立的特異性實驗室檢測JSRV