抗氧化性生物活性物質(zhì)對雞等級前卵泡細胞發(fā)育的影響及其機理的研究.pdf

1、家禽卵巢以其卵泡等級發(fā)育的特點而成為研究卵巢生物學和卵泡發(fā)育的理想模型,而卵泡顆粒細胞因其獨特的結(jié)構(gòu)特點及其在卵泡發(fā)育中的重要作用,常被看作卵泡發(fā)育的一個重要標志。本實驗通過小黃卵泡顆粒細胞以及全卵泡體外培養(yǎng)模型,探討了家禽生產(chǎn)中部分重要的生殖激素、生長因子及與卵泡發(fā)育相關(guān)的抗氧化性生物活性物質(zhì)對卵泡粒細胞生長發(fā)育和功能的影響及其作用機理,以期為家禽優(yōu)勢卵泡選擇及繁殖性能的提高提供理論依據(jù)。1.雞等級前卵泡細胞的形態(tài)學變化-卵泡刺激素和

2、前列腺素對等級前卵泡發(fā)育的影響
　　 本文首先利用形態(tài)學方法研究了雞等級前卵泡中顆粒細胞和膜細胞在發(fā)育過程中形態(tài)學的變化。從有規(guī)則產(chǎn)蛋周期的三黃母雞中取出等級前卵泡,按照其直徑分為小白卵泡(SWF,1～3 mm)、大白卵泡(LWF,3～5 mm)、小黃卵泡(SYF,5～6 mm)和大黃卵泡(LYF,6～9 mm)。各級卵泡用4％多聚甲醛固定24 h,然后包埋并切片,厚度5μm。切片用蘇木精-伊紅染色或用增殖細胞核抗原(PCNA)

3、免疫組織化學染色。等級前卵泡組織學研究結(jié)果表明:SWF只有一層顆粒細胞,LWF中出現(xiàn)兩層顆粒細胞,而SYF和LYF中則有多層顆粒細胞。數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,卵泡膜層和顆粒細胞層厚度隨著卵泡直徑的變化而顯著增加。SYF和LYF的膜細胞層的厚度是最大的(P＜0.05)。顆粒細胞的密度度隨著卵泡直徑的變化而顯著增加(P＜0.05)。與LWF、SYF和LYF相比,SWF的顆粒細胞的面積較小(P＜0.05)。PCNA免疫組化染色表明:和LYF相比,PCN

4、A標記指數(shù)(PCNA-LI)在SWF、LWF和SYF中較高。因此,在卵泡的發(fā)育過程中,膜細胞和顆粒細胞在形態(tài)和增殖特性上具有階段特異性。卵泡體外懸浮培養(yǎng)實驗表明,卵泡刺激素(FSH)和前列腺素PGE1刺激SYF和LYF中顆粒細胞的增殖,但對膜細胞無顯著促增殖作用。由此推測,FSH和PGE1主要通過刺激顆粒細胞的增殖促使等級前卵泡進入等級發(fā)育。2.人參皂甙對雞等級前卵泡發(fā)育和小黃卵泡顆粒細胞增殖的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的研究
　　

5、人參屬五加科多年生草本植物,其中含有的人參皂甙(GS)因其抗氧化特性而作為保健品,具有調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗疲勞和抗衰老等功效。本文研究了GS對雞等級前卵泡發(fā)育和小黃卵泡顆粒細胞增殖的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。等級前卵泡在0.5％胎牛血清(FCS)中預(yù)培養(yǎng)16 h后換成無血清的培養(yǎng)液,其中含10μg/ml胰島素,5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白和3×10-8mol/L亞硒酸鈉(ITS培養(yǎng)液),同時單獨添加10gμg/ml GS處理24 h。結(jié)果表明:GS

6、顯著刺激SWF、LWF、SYF和LYF的膜層和顆粒層細胞的增殖,提示GS可通過刺激等級前卵泡細胞的增殖而促使其進入等級發(fā)育。從SYF中分離的顆粒細胞在含有0.5％FCS的M199培養(yǎng)液中培養(yǎng),16 h后換成無血清培養(yǎng)液并繼續(xù)進行培養(yǎng),同時用PKC抑制劑H7、PKC激活劑PMA單獨或與GS聯(lián)合處理24 h。隨后進行細胞形態(tài)學和GS作用機理的研究。結(jié)果顯示:當GS濃度在0.1～10μg/ml范圍時,顆粒細胞的數(shù)量呈顯著上升趨勢,并呈一定的劑

7、量-效應(yīng)關(guān)系。同時,這一效應(yīng)可以被H7所抑制,但可被PMA所加強。顆粒細胞的PCNA-LI統(tǒng)計結(jié)果顯示細胞的增殖活性與顆粒細胞的數(shù)目變化呈現(xiàn)類似的變化。Western印跡法表明10μg/ml GS可促進顆粒細胞中PKC從胞質(zhì)到胞膜的轉(zhuǎn)移,而H7則抑制此效應(yīng)。同時,GS上調(diào)顆粒細胞中細胞周期蛋白D1/周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)和周期蛋白E/CDK2mRNA的表達。然而,用PKC抑制劑H7則減弱了這一刺激效應(yīng)。由此推測,GS通過上調(diào)顆

8、粒細胞中細胞周期蛋白D1/CDK6和E/CDK2的表達來刺激顆粒細胞的增殖,從而促使等級前卵泡進入等級發(fā)育。3.大豆黃酮對雞等級前卵泡發(fā)育和小黃卵泡顆粒細胞增殖的影響
　　 本實驗利用全卵泡培養(yǎng)和顆粒細胞單獨培養(yǎng)模型探討了植物性抗氧化劑大豆黃酮(DAI)對產(chǎn)蛋雞等級前小黃卵泡及顆粒細胞增殖的影響。等級前卵泡在0.5％FCS中預(yù)培養(yǎng)16 h后換成無血清的ITS培養(yǎng)液,同時單獨添加10～1000 ng/ml的DAI處理24 h。結(jié)果

9、表明:DAI顯著刺激SWF、LWF、SYF和LYF的膜層和顆粒層細胞的增殖,提示DAI通過刺激等級前卵泡細胞的增殖而促使其進入等級發(fā)育。采用機械法分散產(chǎn)蛋雞等級前小黃卵泡顆粒細胞。培養(yǎng)液為含0.5％FCS的M199培養(yǎng)液。顆粒細胞預(yù)培養(yǎng)16 h后,撤去血清,換用ITS培養(yǎng)液。細胞用DAI處理24 h后對其增殖活性進行檢測。結(jié)果顯示:10～1000 ng/ml的DAI處理可顯著增加顆粒細胞的數(shù)目(P＜0.05),這一刺激作用可被雌激素受體

10、阻斷劑他莫昔芬所阻斷,并呈現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。同時,顆粒細胞的BrdU-LI結(jié)果顯示出細胞的增殖活性與其數(shù)目的變化呈現(xiàn)出相似的變化。由此推測,DAI可通過雌激素活性刺激顆粒細胞的增殖而促使等級前卵泡進入等級發(fā)育。
　　 總之,本實驗通過在體的形態(tài)學和免疫組化方法研究了產(chǎn)蛋雞等級前卵泡發(fā)育過程中顆粒細胞和膜細胞數(shù)量的變化,膜細胞和顆粒細胞在形態(tài)和增殖特性上呈現(xiàn)出階段特異性。顆粒細胞的增殖活性隨等級前卵泡的發(fā)育而降低。全卵泡體

11、外懸浮培養(yǎng)實驗表明,FSH和PGE1主要通過刺激顆粒細胞的增殖而促使等級前卵泡進入等級發(fā)育；植物性抗氧化劑GS和DAI可顯著刺激SWF、LWF、SYF和LYF中顆粒細胞的增殖,促使等級前卵泡進入等級發(fā)育。利用等級前卵泡顆粒細胞單獨培養(yǎng)模型證明:GS可上調(diào)顆粒細胞中細胞周期蛋白D1/CDK6和E/CDK2 mRNA的表達來促進其增殖,PKC信號途徑可能參與GS對顆粒細胞增殖的調(diào)控；DAI可通過雌激素樣作用顯著促進顆粒細胞的增殖。這些結(jié)果在