玉米應(yīng)答低磷脅迫的消減文庫(kù)構(gòu)建及部分EST序列分析.pdf

1、磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的大量元素之一，直接參與植物體內(nèi)各種重要的生理生化過(guò)程，對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝及提高產(chǎn)量起著重要的作用。土壤中磷的總含量非常豐富，但在酸性條件下磷會(huì)迅速與陽(yáng)離子尤其是鋁和鐵離子形成不溶性化合物，致使磷不易被植物吸收，因此土壤缺磷是全球性的問(wèn)題。土壤中可利用磷的濃度雖然很低，植物在長(zhǎng)期適應(yīng)低磷環(huán)境的過(guò)程中，已經(jīng)進(jìn)化出了一整套適應(yīng)機(jī)制，包括形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育、生化和遺傳上的變化。玉米耐低磷的研究逐漸深入，從耐低磷基

2、因型篩選、形態(tài)、生理生化改變到耐低磷遺傳性狀分析、QTL定位。但有關(guān)玉米耐低磷脅迫下的基因調(diào)控和耐低磷分子機(jī)制方面的研究報(bào)道還較少。
　　 本研究以耐低磷玉米自交系178為材料，進(jìn)行正常培養(yǎng)和低磷脅迫處理。以低磷處理開(kāi)始時(shí)間為原點(diǎn)，在低磷脅迫6h、12h、24h、48h、72h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)取對(duì)照和處理玉米的根系，提取總RNA。然后采用抑制消減雜交技術(shù)構(gòu)建玉米根系應(yīng)答低磷脅迫差異表達(dá)基因正向及反向文庫(kù)，經(jīng)測(cè)序和生物信息學(xué)功能比對(duì)后根

3、據(jù)其同源序列基因的功能推測(cè)EST序列的功能并進(jìn)行分類(lèi)注釋?zhuān)贿\(yùn)用RT-PCR半定量表達(dá)技術(shù)，研究具有重要功能的基因在玉米耐低磷響應(yīng)過(guò)程中的表達(dá)模式；運(yùn)用元分析方法及生物信息學(xué)手段，將單拷貝的EST序列和低磷脅迫相關(guān)QTL位點(diǎn)進(jìn)行共定位分析，探討二者之間的吻合程度，分析具有重要遺傳效應(yīng)和育種潛力的EST序列。取得以下研究結(jié)果：
　　 1.通過(guò)SSH技術(shù)和文庫(kù)構(gòu)建技術(shù)，構(gòu)建了玉米自交系178根系耐低磷差異表達(dá)基因正向文庫(kù)和反向文庫(kù)，分

4、別包含3648個(gè)和2498個(gè)克隆。文庫(kù)中插入的cDNA片段長(zhǎng)度介于100-500bp之間。
　　 2.從正反向文庫(kù)中分別選取103個(gè)和15個(gè)陽(yáng)性克隆測(cè)序后，經(jīng)生物信息學(xué)比對(duì)后，共獲得65條唯一的EST序列，其中已知基因功能的EST序列44條，未知功能的EST序列21條。根據(jù)生物信息學(xué)比對(duì)同源序列基因的功能并結(jié)合前人的研究，將已知基因功能的44條EST序列分為九類(lèi)：能量代謝類(lèi)(2條，3％)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝類(lèi)(18條，28％)、

5、磷素循環(huán)類(lèi)(4條，6％)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)類(lèi)(3條，5％)、細(xì)胞分裂和組成類(lèi)(2條，3％)、脅迫相關(guān)類(lèi)(5條，8％)、蛋白質(zhì)互作類(lèi)(1條，1％)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控類(lèi)(7條，11％)和通道蛋白類(lèi)(2條,3％)。結(jié)果表明，低磷脅迫下的玉米根系表現(xiàn)出能量代謝加劇、蛋白質(zhì)合成的增加、轉(zhuǎn)錄調(diào)控加強(qiáng)、有機(jī)態(tài)磷的分解利用增加和磷素消耗壓縮，發(fā)現(xiàn)根細(xì)胞中存在多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，生長(zhǎng)素合成增加導(dǎo)致細(xì)胞分裂加快，根細(xì)胞加強(qiáng)了保護(hù)機(jī)制以應(yīng)對(duì)低磷脅迫對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的威脅。
　

6、　 3.通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)，從65條EST序列中獲得24條單一拷貝EST序列，將單一拷貝EST序列與已報(bào)道的低磷脅迫相關(guān)QTL位點(diǎn)都定位在玉米染色體圖譜上，共定位分析表明，45.8％的單拷貝EST序列與QTL位點(diǎn)重疊，表明運(yùn)用SSH構(gòu)建的低磷脅迫基因差異表達(dá)文庫(kù)，能篩選較高比例的具有顯著遺傳效應(yīng)的低磷應(yīng)答相關(guān)基因，具有一定可靠性和合理性。可以預(yù)見(jiàn)，隨著EST序列和QTL位點(diǎn)信息的增加，兩者相互之間的共定位區(qū)域會(huì)更加明顯。
　　

7、 4.采用半定量RT-PCR方法，研究來(lái)自不同類(lèi)型的5個(gè)重要功能的基因各時(shí)間段的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)五個(gè)基因表達(dá)量在總體上都呈上升的趨勢(shì)，但具體到各個(gè)時(shí)間段的表達(dá)上又有所差別。根據(jù)5個(gè)基因表達(dá)量上調(diào)的時(shí)間和增幅的大小，可以初步認(rèn)為玉米根系中5個(gè)耐低磷相關(guān)基因的表達(dá)順序?yàn)椋鹤仙嵝粤姿峄盖绑w基因(PAP)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GCS)、假定myb1靶序列基因(TOM)、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶基因(PDI)和生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白基因(AIP

8、)，表明低磷脅迫下玉米根系內(nèi)的生理生化變化發(fā)生在先：磷的虧缺首先促發(fā)對(duì)磷的需求壓力，然后引發(fā)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失衡，需要大量合成相關(guān)蛋白質(zhì)和啟動(dòng)耐低磷下游基因的調(diào)控子，最后生長(zhǎng)素誘導(dǎo)蛋白大量合成引發(fā)了根構(gòu)型改變，因而根構(gòu)型等形態(tài)變化發(fā)生在后，這一結(jié)果與田間觀察結(jié)果以及前人研究結(jié)果基本吻合。
　　 5.本研究運(yùn)用SSH獲得的結(jié)果與前人運(yùn)用基因芯片、蛋白質(zhì)組分析、cDNA-AFLP等方法的研究結(jié)果相互映證，也與谷俊濤等(2009年)在小麥

9、上的研究結(jié)果、李利華等(2009年)在水稻上的研究結(jié)果相似。由此可見(jiàn)，運(yùn)用SSH技術(shù)構(gòu)建低磷脅迫差異表達(dá)基因文庫(kù)、研究玉米耐低磷的機(jī)理具有較高的可靠性和合理性。
　　 6.從整體看玉米低磷脅迫響應(yīng)涉及根系形態(tài)結(jié)構(gòu)、能量代謝、物質(zhì)代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)方面基因，各方面基因間相互作用、密切聯(lián)系，共同構(gòu)成了玉米低磷響應(yīng)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這與前人的研究結(jié)果相一致。
　　 7.低磷脅迫下玉米根系內(nèi)的響應(yīng)過(guò)程是一個(gè)基

10、因順序啟動(dòng)的過(guò)程：首先是磷素循環(huán)類(lèi)基因的啟動(dòng)，然后是脅迫相關(guān)類(lèi)、氨基酸蛋白質(zhì)代謝類(lèi)、生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄調(diào)控靶序列基因的啟動(dòng)，較晚啟動(dòng)的是根細(xì)胞分裂和組成類(lèi)。本研究中基因的啟動(dòng)順序與田間觀察和前人研究結(jié)果中低磷脅迫下玉米根系內(nèi)的生理生化變化發(fā)生8.本研究推測(cè)耐低磷玉米的核心適應(yīng)能力表現(xiàn)在磷素循環(huán)、細(xì)胞保護(hù)和根構(gòu)型三個(gè)主要方面，與前人研究的小麥、水稻耐低磷機(jī)制有相似之處。耐低磷玉米三方面的核心適應(yīng)能力與信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)、氨基