hTERT沉默后消減文庫的構建及初步分析.pdf

1、目的：利用SSH技術篩選出hTERT基因的相關基因，從而尋找出與hTERT基因相關的轉錄調控因子以及轉錄調控通路，為深入研究hTERT基因的激活與調控機制打下基礎。隨著hTERT轉錄激活機制的逐漸明確，必將進一步明確端粒酶在正常和腫瘤細胞中的激活機制，從而為靶向端粒酶的腫瘤治療和腫瘤藥物的研發(fā)提供理論依據。 方法：利用SSH技術對hTERT沉默的hela細胞株進行篩選，以未處理的hela細胞株cDNA為tester，以hTERT

2、沉默的hela細胞株cDNA為driver，進行正向消減雜交；以hTERT沉默的hela細胞株cDNA為tester，以未處理的hela細胞株cDNA為driver，進行反向消減雜交，得到hTERT沉默后的下調（或阻遏表達）和上調（或誘導表達）的兩個cDNA基因文庫。將文庫中的部分基因片段進行生物信息學分析，初步對差異基因進行功能分類。利用半定量RT—PCR以及實時定量PCR進一步驗證由SSH技術獲得的差異片段是否真正代表了hTERT相

3、關的基因。 結果：⑴利用SSH技術得到了hTERT沉默后的下調（或阻遏表達）或上調（或誘導表達）的兩個cDNA基因文庫。通過消減效率分析表明，兩個文庫中的管家基因GAPDH均被消減了近1024倍。因此，SSH技術可用來尋找hTERT沉默后的相關基因。⑵對兩個基因文庫中的部分基因進行生物信息學分析，初步建立了hTERT相關基因功能表達譜。發(fā)現hTERT相關基因功能涉及新陳代謝、能量、轉錄、蛋白合成、蛋白質活性調控、細胞通信及信號轉

4、導、細胞防御與毒性、環(huán)境相互作用、細胞命運、器官分化等方面。⑶對部分差異基因進行半定量RT—PCR以及實時定量PCR分析，發(fā)現在hela細胞和hTERT沉默后的hela細胞中這些基因的表達量確有差異。因此，消減雜交成功，可進一步作為hTERT的相關基因進行研究。 結論：①SSH技術可用來尋找hTERT沉默后的相關基因。②利用SSH技術成功構建了兩個cDNA基因文庫，可進一步作為hTERT的相關基因進行深入研究。③兩個cDNA基因