P53非依賴性信號通路在鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯致體外培養(yǎng)人肝細(xì)胞毒性中的調(diào)控作用.pdf

1、鄰苯二甲酸二（2-乙基已基）酯（di(2-ethylbexyl) phthalate，DEHP）是工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的增塑劑。由于DEHP與塑料成分之間不以化學(xué)鍵共價結(jié)合，因此易從塑料制品中轉(zhuǎn)移至外環(huán)境而造成大氣、水和土壤的污染，已成為全球性環(huán)境污染物之一。人類可通過呼吸道、消化道和皮膚等途徑暴露DEHP，因此DEHP的毒性作用及其潛在健康危害備受國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。盡管已有DEHP的肝毒性、腎毒性、生殖和發(fā)育毒性以及對機體免疫功能干擾等

2、的研究報導(dǎo)，但是，迄今有關(guān)DEHP肝毒性的分子調(diào)控機制以及人群肝損害的流行病學(xué)研究報導(dǎo)仍十分有限。
　　DEHP的肝毒性作用主要是由其活性代謝產(chǎn)物如鄰苯二甲酸單（乙基己基）酯（mono-(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP）等所致。前期研究表明DEHP致肝毒性依賴于過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators activated receptors，PPAR）途徑。近來發(fā)現(xiàn)，D

3、EHP致肝毒性的調(diào)控機制并非僅依賴PPAR途徑，可能與其促發(fā)的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及癌基因的激活有關(guān)。眾多關(guān)鍵蛋白和細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路參與了DEHP致肝毒性過程。抑癌基因p53及其下游靶基因sestrins家族參與了DEHP誘發(fā)肝細(xì)胞氧化損傷過程中的一系列分子事件，磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B-哺乳動物雷帕霉素（phosphatidylinositol3-kinase/protein kinase B/mammalian target of

4、 rapamycin，P13K-PKB-mTOR）信號通路參與到細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)失衡的調(diào)控過程中。
　　基于現(xiàn)有科學(xué)研究結(jié)果，學(xué)者們提出了DEHP致肝細(xì)胞毒性機制的兩種假說，其一為氧化損傷假說：DEHP促發(fā)肝細(xì)胞β氧化反應(yīng)和活性氧的累積，導(dǎo)致胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)的失衡及氧化性DNA損傷；其二為細(xì)胞增殖和凋亡失衡假說：DEHP影響正常的細(xì)胞周期進程，導(dǎo)致細(xì)胞增殖和凋亡穩(wěn)態(tài)的失衡，進而形成腫瘤。在不同種屬的肝細(xì)胞中，DEHP引起的毒性機

5、制差異性較大，因此何種假說占主導(dǎo)地位亦存在爭議。
　　鑒于此，本研究擬用DEHP處理人胚肝細(xì)胞L02、人肝癌細(xì)胞HepG2和p53缺失型人肝癌細(xì)胞Hep3B，初步評價DEHP的肝細(xì)胞毒性以及p53和sestrins在DEHP致人肝細(xì)胞氧化損傷中的調(diào)控作用，并探索性研究PI3K-AKT-mTOR信號通路在DEHP致Hep3B細(xì)胞增殖中的調(diào)控機制，旨在為后續(xù)深入研究DEHP致肝細(xì)胞毒性的分子機制提供科學(xué)依據(jù)。本研究分為兩個部分：

6、>　　第一部分、p53及sestrins在DEHP致人肝細(xì)胞氧化性DNA損傷中的調(diào)控作用
　　L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞分別用DEHP（62.5μM、125μM、250μM、500μM和1000μM）和DMSO（<0.1％，溶劑對照）處理。根據(jù)研究設(shè)計在觀察時點用適宜的方法收集靶細(xì)胞進行如下項目的檢測：（1）在12h、24h和48h時點測定靶細(xì)胞的活力；（2）在24h、48h和72h時點測定CYP1A1和CYP3A

7、4代謝酶活性；（3）在2h、4h、6h、8h、12h和24h研究時點評價靶細(xì)胞的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）和總抗氧化能力（total anti-oxidation capability，T-AOC）水平；（4）在12h和24h時點分析靶細(xì)胞8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8-hydroxy-2'-deoxy

8、guanosine，8-OHdG）水平和細(xì)胞周期時相分布；（5）在24h時點分析p53、p73及sestrins基因mRNA和蛋白表達水平。
　　研究結(jié)果如下：
　　（一）細(xì)胞活力
　?、貺02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞用DEHP處理12h、24h和48h后，除62.5μM處理組的L02細(xì)胞在12h時點有細(xì)胞活力升高外（p<0.01），其他處理組的細(xì)胞活力與對照組相比均有降低（p<0.05或p<0.01）。
　?、谟肈

9、EHP處理Hep3B細(xì)胞12h,24h和48h后，除24h時點外，其他觀察時點所有處理組的細(xì)胞活力均降低（p<0.05或p<0.01）。24h時點的所有處理組細(xì)胞活力顯著性上升（p<0.05或p<0.01），在250μM處理組達到峰值，與對照組相比上升了30％（p<0.01）。
　?。ǘ┐x酶活性
　?、貲EHP處理L02細(xì)胞24h后，除62.5μM處理組外，其他所有處理組的CYP3A4酶活性顯著性升高（p<0.05或p<

10、0.01），并在125μM處理組達到峰值，比對照組上升了35％（p<0.01）。
　　②DEHP處理HepG2細(xì)胞48h后，所有處理組的CYP3A4酶活性顯著性升高（p<0.05或p<0.01），在1000μM處理組達到峰值，是對照組的5.8倍（p<0.01）。
　?、跠EHP處理Hep3B細(xì)胞24h后，除62.5μM處理組外，其他所有處理組的CYP3A4酶活性顯著性增高（p<0.05或p<0.01），在1000μM處理組達

11、到峰值，為對照組的2.25倍（p<0.01）。
　?。ㄈ┭趸瘧?yīng)激指標(biāo)
　?、僭谘芯坑^察時段（0h-24h），DEHP引起L02細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞ROS水平顯著性上升（p<0.05或p<0.01）。在24h時點，62.5μM、125μM和1000μM處理組的L02細(xì)胞和所有處理組的Hep3B細(xì)胞ROS水平顯著性上升（p<0.05或p<0.01），分別在1000μM和250μM處理組達到峰值，與對照組相比，分別上升了45％和

12、46％（p<0.01）。DEHP處理HepG2細(xì)胞0h-24h后，ROS水平呈波動性變化。在24h時點，所有處理組的ROS水平均降低，在62.5μM處理組達到最低值，與對照組相比，降低了60％（p<0.01）。
　?、谠谘芯坑^察時段（2h-24h） DEHP引起L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞MDA水平波動性變化，在1000μM處理組的L02細(xì)胞（6h）、62.5μM處理組的HepG2細(xì)胞（12h）以及125μM處理組的

13、Hep3B細(xì)胞（24h）檢測到MDA的峰值，與對照組相比，MDA水平分別上升了40％、100％和100％（p<0.01）。
　?、墼谘芯坑^察時段（2h-24h），DEHP引起L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞所有處理組的GSH水平顯著性降低，并均在24h時點的1000μM處理組降至最低值，與對照組相比，分別下降了33％、28％和26％（p<0.01）。
　?、茉谘芯坑^察時段（2h-24h），DEHP引起HepG2細(xì)胞

14、和Hep3B細(xì)胞T-AOC水平波動性變化，對L02細(xì)胞未形成影響。在HepG2細(xì)胞的125μM處理組（24h）和Hep3B細(xì)胞的250μM處理組（8h）觀察到其峰值，分別為對照組的10倍和1.6倍（p<0.01）。
　?、軩EHP處理L02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞和Hep3B細(xì)胞24h時點，所有處理組的8-OHdG水平均有顯著性升高（p<0.05和p<0.01），分別在500μM處理組的L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞以及62.5μM處理組

15、的Hep3B細(xì)胞檢測到8-OHdG峰值，與對照組相比，分別上升至1.33倍、5倍和7.3倍（p<0.05和p<0.01）。
　?。ㄋ模┭趸瘧?yīng)激相關(guān)基因及其蛋白的表達水平
　　DEHP誘導(dǎo)了L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞p53、p73和sestrins mRNA水平上調(diào)和Hep3B細(xì)胞sestrins mRNA水平下調(diào)：
　　①DEHP處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h時點，在250μM和500μM處理組的p53和p73

16、mRNA表達水平升高（p<0.05或p<0.01），并均在500μM處理組達到最高值，分別是對照組的2倍和54倍（L02細(xì)胞）及2.1倍和38倍（HepG2細(xì)胞）（p<0.01）。
　?、贒EHP處理L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞24h，250μM和500μM處理組的sestrins基因家族mRNA表達水平顯著上調(diào)（p<0.05和p<0.01），其中以sestrin3 mRNA表達水平上調(diào)最為明顯，并在500μM處理組檢測最高表達水平

17、，分別是對照組的1.8倍（L02細(xì)胞）和9倍（HepG2細(xì)胞）（p<0.01）。
　　③DEHP處理Hep3B細(xì)胞24h，所有處理組的sestrins家族mRNA表達水平均下調(diào)（p<0.05），其中sestrin3表達水平下調(diào)最為明顯，在125μM處理組其表達水平比對照組下調(diào)了5倍（p<0.05）。
　?、茉谌齻€細(xì)胞株中，均未檢出P53、P73及Sestrins蛋白的表達，提示研究基因是在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控的。
　?。ㄎ?/p>

18、）細(xì)胞周期時相分布
　?、貲EHP處理L02細(xì)胞24h，細(xì)胞被阻滯在G1/S期和G2/M期，其中250μM、500μM和1000μM處理組的G1/S期細(xì)胞數(shù)和所有處理組的G2/M期細(xì)胞數(shù)均有顯著性上升（p<0.05或p<0.01），并在1000μM處理組觀察到峰值，與對照組相比，G1/S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)上升15％和18％（p<0.01）；同時所有處理組的S期細(xì)胞數(shù)均顯著性下降，1000μM處理組的S期細(xì)胞數(shù)與對照組相比下降了3

19、3％（p<0.01）。
　　②DEHP處理Hep3B細(xì)胞24h后細(xì)胞周期加速，其中62.5μM、125μM和1000μM的G1/S期和所有處理組的G2/M期細(xì)胞數(shù)顯著性減少，但是，所有處理組的S期細(xì)胞數(shù)均顯著性增加（p<0.05或p<0.01）；其中1000μM處理組（G1/S期）和500μM處理組（G2/M期）的細(xì)胞數(shù)降至最低，與對照組相比，分別降低了21％和10％（p<0.05或p<0.01），1000μM處理組的S期細(xì)胞數(shù)出

20、現(xiàn)峰值，與對照組相比上升了27％（p<0.01）。
　?、畚礄z出DEHP對HepG2細(xì)胞周期時相分布的影響。
　　結(jié)論：不同靶細(xì)胞的DEHP肝細(xì)胞毒性表現(xiàn)形式有差異性：
　　①DEHP誘導(dǎo)了L02細(xì)胞和HepG2細(xì)胞ROS、MDA和8-OHdG水平上升，以及p53、p73和sestrins mRNA表達水平的上調(diào)。僅在L02細(xì)胞檢測到細(xì)胞阻滯在G1/S期和G2/M期。
　　②DEHP引起Hep3B細(xì)胞ROS、MD

21、A和8-OHdG水平上升，以及sestrins基因mRNA水平下調(diào)，同時促進細(xì)胞進入G1/S期、G2/M期和S期復(fù)制。由此推測，由于Hep3B是p53基因缺失型細(xì)胞株，DEHP致細(xì)胞DNA受到氧化性損傷后，細(xì)胞未能進入正常的G1期和G2期阻滯階段，進而促進了細(xì)胞的有絲分裂。
　　第二部分、PI3K-AKT-mTOR信號通路在DEHP致人肝細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用
　　第一部分研究結(jié)果提示DEHP致不同靶細(xì)胞氧化損傷后的應(yīng)答反應(yīng)是

22、明顯不同。鑒于有研究報道肝腫瘤細(xì)胞的異常增殖過程中常伴隨著p53基因的突變和丟失和DEHP致肝臟毒性存在不依賴于p53的信號通路的調(diào)控等科學(xué)線索，本部分進行了p53非依賴型信號通路PI3K-AKT-mTOR在DEHP致Hep3B細(xì)胞增殖中的調(diào)控作用的探索性研究。根據(jù)研究目的，本部分以Hep3B細(xì)胞為靶細(xì)胞，設(shè)定了DEHP單獨染毒組（62.5μM、125μM、250μM、500μM和1000μM）、DEHP與PI3K蛋白激酶抑制劑LY29

23、4002（50μM）聯(lián)合染毒組，同時設(shè)定了溶劑對照組（DMSO<0.1％）。在24h觀察時點進行如下項目的檢測：細(xì)胞活力、氧化應(yīng)激水平、8-OHdG水平、線粒體膜電位水平、細(xì)胞S期DNA復(fù)制水平（BrdU檢測方法）、細(xì)胞周期時相分布和PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達水平。
　　研究結(jié)果如下：
　?。ㄒ唬┘?xì)胞活力
　　Hep3B細(xì)胞用DEHP配伍LY294002（10μM、20μM、30μM

24、、40μM和50μM）處理24h的實驗結(jié)果顯示：50μM的LY294002能夠明顯抑制DEHP致Hep3B細(xì)胞活力增加。因此，后續(xù)實驗選擇50μM作為該抑制劑的干預(yù)劑量。
　?。ǘ┭趸瘧?yīng)激指標(biāo)
　?、貲EHP單獨染毒Hep3B細(xì)胞24h，所有處理組的ROS水平持續(xù)上升（p<0.05或 p<0.01）（結(jié)果見第一部分）。但用設(shè)定劑量的抑制劑后，所有處理組ROS水平顯著性下降（p<0.05），在1000μM處理組的抑制率達到最

25、高，與對照組相比下降了30％（p<0.05）。
　?、贒EHP單獨染毒 Hep3B細(xì)胞24h，所有處理組的GSH水平持續(xù)下降（p<0.05 和p<0.01）。但用設(shè)定劑量的抑制劑后，除500μM處理組外，其他處理組GSH水平顯著性上升，在1000μM處理組上升至峰值，與對照組相比升高了20％（p<0.05）。
　　③DEHP 單獨染毒Hep3B細(xì)胞24h，所有處理組的8-OHdG水平顯著性上升（p<0.01），在125μM處

26、理組的細(xì)胞8-OHdG 水平達到最高，與對照組相比上升至7.3倍（p<0.01）。但用設(shè)定劑量的抑制劑后，所有處理組的8-OHdG水平未觀察到明顯抑制。
　?。ㄈ〥NA復(fù)制水平
　　DEHP單獨染毒Hep3B細(xì)胞24h，所有處理組的S期DNA復(fù)制水平顯著性上升（p<0.01），并在1000μM處理組達到峰值，與對照組相比，上升了4.5倍（p<0.01）。用設(shè)定劑量的抑制劑后，除125μM處理組外，其他各處理組DNA復(fù)制水平

27、顯著性下降，在1000μM處理組的抑制率達到峰值，與對照組相比下降了60％（p<0.01）。
　　（四）線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，MMPorψm）
　　DEHP單獨染毒Hep3B細(xì)胞24h，62.5μM、125μM和250μM 處理組的線粒體膜電位水平（ψm）顯著性上升（p<0.05），并在250μM處理組達到峰值，與對照組相比，上升了17％（p<0.05）。當(dāng)用設(shè)定劑量

28、的抑制劑后，除1000μM處理組外，其他處理組的線粒體膜電位水平顯著性下降，在250μM處理組的抑制率達到峰值，與對照組相比下降了29％（p<0.05）。
　?。ㄎ澹┘?xì)胞周期時相分布
　　DEHP單獨染毒 Hep3B 細(xì)胞24h后，細(xì)胞周期時相中的G1/S期、G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加，S期細(xì)胞數(shù)量減少（p<0.05和p<0.01，結(jié)果見第一部分）；但用設(shè)定劑量的抑制劑后，所有處理組的細(xì)胞周期恢復(fù)正常，與對照組相比無顯著性差異（

29、p>0.05）。
　?。㏄I3K-AKT-mTOR通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達水平
　　DEHP單獨染毒Hep3B細(xì)胞24h后，pi3k、akt、mtor和p70s6k基因mRNA水平上調(diào)（p<0.05 和p<0.01）。用設(shè)定劑量的抑制劑后，靶蛋白的表達水平均降低，其中①除62.5μM處理組外，其他各處理組的pi3k基因mRNA水平均上調(diào)，其中在1000μM處理組處達到峰值，與對照組相比上調(diào)了3.7 倍（p<0.01

30、）；但用設(shè)定劑量的抑制劑后，1000μM處理組的抑制率與對照組相比下降了54％（p<0.01）；②62.5μM、125μM、500μM和1000μM處理組的akt mRNA表達水平上調(diào)，并在125μM處理組達到最高值，與對照組相比，上調(diào)了7倍（p<0.01）。用設(shè)定劑量的抑制劑后，在125μM處理組抑制率達到峰值，與對照組相比下降了14倍（p<0.01）；③62.5μM、125μM和250μM處理組的mtor和所有處理組的p70s6k

31、mRNA表達水平上調(diào)，均在62.5μM處理組達到最高值，分別比對照組上調(diào)了22倍和19倍（p<0.01）。但用設(shè)定劑量的抑制劑后，62.5μM處理組的抑制率達到最低，與對照組相比分別下降了4.4倍和9.5倍（p<0.01）；DEHP單獨染毒Hep3B細(xì)胞24h后，p-AKT308、p-AKT473、mTOR和P70S6K蛋白表達水平均顯著性上調(diào)（p<0.05 或 p<0.01），并在250μM處理組達到峰值，與對照組相比，分別上升了66

32、％、46％、143％和90％（p<0.01）；但用設(shè)定劑量的抑制劑后，250μM處理組抑制率最大，與對照組相比分別下降了15％、40％、60％和40％（p<0.01）。
　　結(jié)論：本部分研究結(jié)果表明：①DEHP引起Hep3B細(xì)胞的氧化損傷，通過激活的PI3K-AKT-mTOR信號通路誘導(dǎo)了相關(guān)基因（pi3k、akt、mtor和p70s6k）及其蛋白表達水平的上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞S期DNA復(fù)制水平和線粒體膜電位水平的升高，促進了G1/S期

33、、G2/M期和S期進程；②抑制劑LY294002在一定劑量（50μM）可明顯改善Hep3B細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，但未能修復(fù)胞內(nèi)氧化性DNA損傷，并且抑制了PI3K-AKT-mTOR信號通路相關(guān)基因及其蛋白表達水平，降低了細(xì)胞S期DNA復(fù)制水平，促進線粒體膜電位的恢復(fù)，使得細(xì)胞周期趨于正常，細(xì)胞增殖得以抑制。由此我們推測：DEHP經(jīng)胞內(nèi)CYP3A4酶系代謝成活性產(chǎn)物，此過程中形成的ROS聚積破壞了線粒體膜電位，引起氧化損傷，受損后的細(xì)胞由于

34、p53基因缺失而未能進入正常的周期阻滯過程。同時，過量ROS也激活了PI3K-AKT-mTOR信號通路。在兩者的共同作用下，加速了Hep3B細(xì)胞周期進程，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。
　　綜上所述，本研究結(jié)果初步揭示：①p53、p73及sestrins基因參與了DEHP致人肝細(xì)胞氧化性DNA損傷的調(diào)控；②抑制劑LY294002可以改善DEHP誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激，但對氧化性DNA損傷未能發(fā)揮保護作用；③DEHP致Hep3B細(xì)胞的異常增殖可能是

35、p53基因缺失和PI3K-AKT-mTOR信號通路激活的共同作用所致。顯然，在本實驗條件下，DEHP致肝細(xì)胞毒性是氧化DNA損傷與修復(fù)失衡和細(xì)胞增殖與凋亡的失衡共存的結(jié)果。p53在此兩種平衡中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。
　　創(chuàng)新點：
　　1. 發(fā)現(xiàn)p53、p73及sestrins基因參與DEHP致人肝細(xì)胞氧化性DNA損傷的調(diào)控。p53對DEHP致人肝細(xì)胞氧化性DNA損傷可能有保護作用。
　　2. 發(fā)現(xiàn)DEHP致Hep3B細(xì)胞的異