hiv2

1、實驗室實驗室HIVHIV檢測技術概述及進展檢測技術概述及進展時間：200931116:57:31關鍵詞關鍵詞】獲得性免疫缺陷綜合征HIV實驗室技術和方法艾滋病(AIDS)又稱獲得性免疫缺陷綜合征，是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染所引起的一種免疫缺陷性疾病［1］。HIV感染的診斷是艾滋病預防控制工作的重要組成部分，建立敏感實用的檢測方法對于監(jiān)測、診斷或血液篩查，控制艾滋病的流行顯得尤為重要。以下本文就HIV的檢測技術現(xiàn)狀及進展做一綜述。

2、1HIVHIV的感染機制及感染標志的感染機制及感染標志HIV病毒侵入人體后，其表面糖蛋白gp120與細胞表面受體蛋白CD4以高親和力結合，吸附到宿主細胞上；gp120再與宿主細胞表面輔助受體相互作用，使病毒與宿主細胞膜更接近；gp41產生一系列構象變化，其N端的融合肽片段插入宿主細胞膜，導致病毒包膜與細胞膜的最終融合，病毒RNA進入細胞。在HIV感染后，最先能夠監(jiān)測到病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗體［2］。在感染后的10～14d

3、內，病毒RNA水平是呈指數(shù)上升，隨后下降并保持在持續(xù)穩(wěn)定的水平上，進入HIV無癥狀期［3］。p24抗原水平隨著病毒RNA水平的發(fā)展而發(fā)展，在急性感染期就可以出現(xiàn)，被認為是病毒復制的間接標志，但由于檢測方法的靈敏度不夠而使得其檢出時間要比RNA晚。從HIV感染到能夠檢測出HIV抗體這一時期被稱作“窗口期”。在窗口期，能夠通過病毒RNA、p24抗原和CD4淋巴細胞水平來確定HIV感染。CD4淋巴細胞水平隨著感染的發(fā)展而逐漸下降當其在血液中細

4、胞下降到200個mL時，就會發(fā)生嚴重的免疫缺陷，患者就被確診為艾滋病。病毒RNA、p24抗原、HIV抗體和CD4淋巴細胞水平可以用來確定HIV感染、檢測病情發(fā)展［4］。HIV在病毒分類中屬逆轉錄病毒科慢病毒屬中的人類免疫缺陷病毒組。迄今為止，根據(jù)血清學反應和病毒核酸序列測定，全球流行的HIV可分為2型：HIV1型和HIV2型［5］。在HIV1型內，根據(jù)編碼包膜蛋白的env基因和編碼殼蛋白的gag基因序列的同源性又進一步分為3個組：

5、Ｍ組（主要組）、Ｏ組（外圍組）和Ｎ組（新組或非M非O組），Ｍ組內又可分為ＡＪ10個亞型。在HIV1型和HIV2型之間其核苷酸序列有45％的同源性，并且存在免疫交叉反應。應用免疫印跡法(Westblot)可以將二者明確地區(qū)別開來［6］。2HIVHIV感染的主要檢測方法感染的主要檢測方法目前檢測HIV的方法有100多種［7］，總體來說可以分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。病毒檢測包括細胞培養(yǎng)(病毒分離)、p24抗原檢測和病毒核酸檢測。早期

6、對HIV的診斷主要是通過血清學試驗檢測抗HIV的抗體間接地診斷HIV感染。近幾年，分子生物學方法不斷被應用到HIV的檢測中，HIV的實驗室診斷方法取得了很大的進展，核酸檢測已經成為了HIV實驗室診斷的發(fā)展方向［8］?？贵w通常是在感染后3～8周能夠被檢測出來［9］。目前，大多應用雙抗原夾心法，這種方法具有很好的靈敏性和特異性?？贵w檢測由初篩和確認試驗組成，初篩試驗呈陽性的必須進行確認試驗。酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)方法有一定的靈敏度，

7、且操作簡單、快速，適合對大量樣品的檢測。因此，是目前臨床2.1.3免疫熒光試驗(IFA)基本原理為應用Ｈ9或HUT78培養(yǎng)細胞作為載體用HIV感染細胞該細胞內就會含有HIV抗原將HIV感染的淋巴細胞涂于玻片上固定，制備為抗原片加入待檢血清，待檢血清中的抗HIV抗體與抗原結合后再與熒光素標記的抗人Ig結合在熒光顯微鏡下可見到細胞內有黃綠色熒光。2.1.4明膠顆粒凝集試驗(PA)PA的基本過程是先將樣品稀釋然后分別加入經抗原致敏的和未致

8、敏的明膠顆粒混勻后保溫(一般為室溫)。當血清中有HIV抗體存在時經抗原致敏的明膠顆粒與抗體發(fā)生抗原抗體反應根據(jù)明膠顆粒在孔中的凝集情況判讀結果。PA操作簡便無需特殊儀器設備適合對少量標本的檢測。2.1.5斑點印跡試驗(或免疫層析或滲濾)斑點印跡試驗一般采用硝酸纖維素膜作固相載體用HIV抗原包被于固相載體加入待測標本(可為血清、血漿、尿液和其他體液)一定溫度反應后洗去未結合于固相載體上的標本包被抗原和被檢血清中抗體結合用膠體金(或膠體硒)

9、代替底物連接在葡萄球菌蛋白Ａ上金標記蛋白Ａ具有與人Ig結合的能力因而可與被捕獲的HIV抗體結合。若樣品中有HIV抗體則薄膜上就會產生一桔紅色斑點(或線條)一般3～10min出結果特異性較好較為適宜于偏遠地區(qū)臨床用血檢測但不適于城市地區(qū)的獻血員篩查。2.2分子生物學方法隨著生物技術的發(fā)展核酸檢測得到了人們越來越多的重視它可直接檢查HIVRNA可在發(fā)現(xiàn)血清學變化之前檢測HIV感染而且比Ｐ24抗原檢測方法更靈敏［16］。2.2.1多聚酶鏈反應

10、檢測法PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性—退火—延伸三個基本反應步驟構成。①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。②模板DNA與引物的退火(復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。③引物的

11、延伸：DNA模板—引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成1條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環(huán)變性—退火—延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成1個循環(huán)需2～4min，2～3h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。檢測HIVRNA需要先利用逆轉錄反應將RNA轉錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進行PCR擴增即