乳鐵蛋白水解物中抗菌肽的分離與純化.pdf

1、抗菌肽不僅具有廣譜抗菌作用，對(duì)病毒、寄生蟲、癌細(xì)胞等也有抑制和殺滅作用。乳鐵蛋白水解物(LHs)中就有抗菌肽的存在，且乳鐵蛋白抗菌肽酸性條件下活性極高，無(wú)毒無(wú)害，易被人體吸收，在食品添加劑，尤其是飲料的添加劑方面有著廣闊的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)的主要內(nèi)容就是對(duì)LHs中的抗菌肽進(jìn)行分離純化。
　　本研究利用胃蛋白酶水解乳鐵蛋白，制備水解物。水解條件為乳鐵蛋白底物濃度5％，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間4h，E/S是1000U·g-1，反應(yīng)pH為

2、2.5。對(duì)LHs先后進(jìn)行鹽析、凝膠過濾分離色譜、半制備型高效液相色譜分離等三步純化，以大腸桿菌（Escherichia coli）為檢測(cè)菌，抗菌性為指標(biāo)測(cè)定LHs的抑菌活性。具體的研究結(jié)果如下:
　　(1)乳鐵蛋白被水解后呈長(zhǎng)短不一的肽段，本研究選擇葡聚糖凝膠Sephadex G-25進(jìn)行凝膠過濾分離，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，確定洗脫液為0.1mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)，洗脫速度0.5mL/min，上樣量1mL，上樣濃度25mg/mL，紫外

3、檢測(cè)器波長(zhǎng)280nm。經(jīng)過一步純化凝膠過濾色譜圖有一個(gè)拖尾的峰，收集、冷凍干燥、分析抑菌性，產(chǎn)物抑菌率為19.0％。
　　(2)為改善分離效果，凝膠過濾前采用鹽析法將水解物分級(jí)。選取不同飽和度硫酸銨((NH4)2SO4)溶液(20％-60％)鹽析LHs，鹽析產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-25凝膠過濾，并分析其抑菌活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，(NH4)2SO4在35％飽和度時(shí)析出的LHs的抑菌性最強(qiáng)。經(jīng)過鹽析和凝膠過濾分離兩步純化的產(chǎn)物凝膠色

4、譜圖有分明的峰Ⅰ峰Ⅱ兩個(gè)峰，峰Ⅰ抑菌率更高，為88.0％，峰Ⅰ中含有目標(biāo)抑菌活性物質(zhì)。凝膠過濾的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了脫鹽。
　　(3)采用RP-HPLC對(duì)二次純化產(chǎn)物峰Ⅰ進(jìn)行再次純化，上樣量為100μL，樣品濃度40mg/mL，柱溫35℃，0.1％的三氟乙酸水溶液作為流動(dòng)相A液，98％的色譜級(jí)乙腈和0.1％三氟乙酸溶液作為流動(dòng)相B液，洗脫速度3.0mL/min，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254nm。結(jié)果中顯示有峰a和幾個(gè)很小的雜峰，經(jīng)過收集、冷凍干燥和