誘導(dǎo)HO-1對(duì)老年骨骼肌微環(huán)境及肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化的影響.pdf

1、背景和目的:
　　伴隨機(jī)體老化進(jìn)程，骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量和功能逐步減少減退，這是老年骨骼肌再生能力下降的主要原因。肌衛(wèi)星細(xì)胞微環(huán)境對(duì)其增殖分化具有重要影響。課題通過(guò)研究改善老年小鼠骨骼肌組織氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等微環(huán)境變化，觀察對(duì)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化潛能和骨骼肌損傷再生的影響，以探討促進(jìn)老年骨骼肌再生能力的新途徑，為增齡性骨骼肌丟失癥等肌萎縮性疾病的防治提供對(duì)策。
　　方法:
　　1.分別將正常成年（2月齡）和老年(18月齡

2、)C57BL/6雄性小鼠按照簡(jiǎn)單隨機(jī)抽樣法分為對(duì)照組及注射鈷原卟啉(Cobalt Protoporphyrin，CoPP)組;CoPP組小鼠連續(xù)3d腹腔注射CoPP溶液[5 mg/(kg·d)]，對(duì)照組注射同體積生理鹽水。
　　2.Western Blot檢測(cè)成年和老年小鼠骨骼肌組織對(duì)照組和誘導(dǎo)劑CoPP處理組血紅素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1，HO-1)蛋白表達(dá)變化;
　　3.ELISA檢測(cè)成年和老年小鼠骨

3、骼肌對(duì)照組、CoPP誘導(dǎo)HO-1組過(guò)氧化標(biāo)志分子丙二醛(Malondialdehyde，MDA)，過(guò)氧化氫(H2O2)含量及抗氧化酶類(lèi)超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)，CuZn-超氧化物歧化酶(CuZn-Superoxide Dismutase，SOD)，谷胱甘肽氧化還原酶(Gluathion Peroxidase，GSH-pX)及過(guò)氧化氫酶(Catalase，CAT)活性變化。
　　4.建立老年

4、小鼠腓腸肌損傷模型，髓過(guò)氧化物酶(Myeloperoxidase，MPO)，CD163免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)老年小鼠骨骼肌損傷對(duì)照及損傷后CoPP誘導(dǎo)HO-1組中性粒細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn);Western Blot檢測(cè)CD163蛋白表達(dá)變化。
　　5.Western Blot和Real-Time PCR分別從蛋白和RNA水平檢測(cè)老年小鼠骨骼肌損傷不同時(shí)間點(diǎn)CoPP誘導(dǎo)HO-1組MyoD，Myogenin表達(dá)變化。
　　6.H

5、E染色，胚胎肌球蛋白重鏈(embryonic Myosin Heavy Chain，eMHC)免疫熒光染色觀察老年小鼠骨骼肌損傷對(duì)照和CoPP誘導(dǎo)HO-1組骨骼肌組織，特別是新生肌纖維變化。
　　7.Western Blot檢測(cè)老年小鼠骨骼肌損傷對(duì)照及損傷后CoPP誘導(dǎo)HO-1組Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ，ColⅠ)表達(dá)變化;Masson三色染色觀察CoPP誘導(dǎo)HO-1對(duì)老年小鼠骨骼肌損傷后纖維沉積的影響。
　　結(jié)果:

6、
　　1.在正常小鼠骨骼肌組織，老年組HO-1表達(dá)高于成年組，老年CoPP誘導(dǎo)組HO-1表達(dá)升幅顯著低于成年CoPP誘導(dǎo)組。
　　2.注射CoPP后，成年CoPP誘導(dǎo)組和老年CoPP誘導(dǎo)組T-SOD、CuZn-SOD酶活性均升高，MDA含量降低;老年CoPP誘導(dǎo)組T-SOD，CuZn-SOD酶活性低于成年CoPP誘導(dǎo)組，MDA含量高于成年CoPP誘導(dǎo)組。
　　成年CoPP誘導(dǎo)組和老年CoPP誘導(dǎo)組GSH-Px、CAT酶

7、活性升高，H2O2含量降低;老年CoPP誘導(dǎo)組GSH-Px酶活性高于成年CoPP誘導(dǎo)組，CAT酶活性低于成年CoPP誘導(dǎo)組，H2O2含量高于成年CoPP誘導(dǎo)組。
　　3.老年小鼠骨骼肌損傷后，CoPP誘導(dǎo)組中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)在3d，7d均低于對(duì)照組;CD163陽(yáng)性M2型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)出現(xiàn)較晚，注射CoPP后，M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著高于損傷對(duì)照組。
　　4.老年小鼠骨骼肌損傷后，注射CoPP誘導(dǎo)HO-1表達(dá)3d，7d，14d，實(shí)驗(yàn)

8、組MyoD，Myogenin表達(dá)水平顯著高于損傷對(duì)照組，7d時(shí)MyoD有最大表達(dá)量，Myogenin的最大表達(dá)量出現(xiàn)在14d。
　　5.老年小鼠骨骼肌損傷后，注射CoPP5d，7d時(shí)新生骨骼肌纖維增多;與對(duì)照組比較，CoPP處理組eMHC陽(yáng)性纖維顯著升高。
　　6.老年小鼠骨骼肌損傷后，注射CoPP7d，14d，21d，28d，實(shí)驗(yàn)組ColⅠ蛋白表達(dá)量顯著低于損傷對(duì)照組;膠原纖維數(shù)量同樣低于損傷對(duì)照組。21d時(shí)ColⅠ表達(dá)量

9、和膠原纖維沉積最高。
　　結(jié)論:
　　1.老年小鼠骨骼肌組織HO-1對(duì)外界刺激的反應(yīng)性下降，抗氧化應(yīng)激能力下降。
　　2.CoPP誘導(dǎo)HO-1可以顯著降低成年和老年小鼠骨骼肌組織內(nèi)的過(guò)氧化反應(yīng)，提高抗氧化酶活性，改善肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　3.老年小鼠骨骼肌損傷后，CoPP誘導(dǎo)HO-1能夠降低早期中性粒細(xì)胞、促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)，加快老年小鼠骨骼肌組織的炎癥反應(yīng)進(jìn)程。
　　4.老年小鼠骨骼肌損傷后