膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)1概要

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),,醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn),醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課是一門(mén)操作技能很強(qiáng)的課程。實(shí)驗(yàn)課教學(xué)的主要目標(biāo)是使學(xué)生了解醫(yī)學(xué)微生物學(xué)主要的研究方法和手段，掌握基本技能和基本原理，樹(shù)立牢固的無(wú)菌觀念。更重要的是培養(yǎng)學(xué)生自學(xué)能力、科學(xué)思維能力、動(dòng)手能力和表達(dá)能力。,微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室規(guī)則,進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室必須穿白大衣、戴帽子。書(shū)本、文具放在抽屜里。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不準(zhǔn)吃東西、喝飲料，不準(zhǔn)把任何東西放入嘴中，也不要用手撫摸頭臉等部位。凡是廢棄的細(xì)菌培養(yǎng)物、

2、帶菌材料，應(yīng)放在指定地點(diǎn)等待滅菌處理，不得隨便亂放或用水沖洗。一旦發(fā)生意外，造成污染，應(yīng)立即報(bào)告老師進(jìn)行處理。離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室前，必須洗手。懷疑污染應(yīng)及時(shí)用1‰新潔而滅泡手。每次實(shí)驗(yàn)后，實(shí)驗(yàn)臺(tái)用消毒液擦拭，地板先用濕的拖把拖地以后再掃地，實(shí)驗(yàn)室用紫外線燈照射1小時(shí)。,實(shí)驗(yàn)分組,倆倆相對(duì)4人為一組,組號(hào)編在電源插座上。每組按從前到后,從左到右的順序，分別編號(hào)為甲、乙、丙、丁。,,,,甲 乙 4丙 丁,甲

3、 乙 3丙 丁,甲 乙 2丙 丁,甲 乙 1丙 丁,甲 乙 5丙 丁,甲 乙 8丙 丁,甲 乙 7丙 丁,甲 乙 6丙 丁,甲 乙 10丙 丁,甲 乙 9丙

4、 丁,講 臺(tái),實(shí)驗(yàn)室器材 整齊有序,常用器材擺放順序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤(pán)。試管架上器材：按接種針、接種環(huán)、油性筆和打火機(jī)的順序，分別放置在試管架中間兩行，靠近電源插座一側(cè)?！鞑氖褂靡院?，必須放回原處，依次擺整齊。,普通冰箱(3顆星***)冷藏室(上柜）：溫度4～8℃，保存培養(yǎng)基、細(xì)菌培養(yǎng)物、常用菌種和抗菌素紙片等。冷凍室（下柜）：溫度－18℃，保存診斷血清、血漿，長(zhǎng)期保藏的菌種和抗菌素紙片。,衛(wèi)

5、生工具：掃帚，拖把，撮箕，垃圾筐，放置在冰箱和水池之間。,隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：35～37℃，一般細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間為18～24小時(shí)。,奧林巴斯 CX21型 生物顯微鏡（實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)，每人一臺(tái)）,注意：只能橫放，不得豎放。,1500W電爐▲安全警告培養(yǎng)基沸騰溢出→流入電爐：①觸電→危及生命！②短路→斷電，③…。,蒸餾水：配制培養(yǎng)基。1‰新潔而滅：懷疑病原菌污染，泡手3～5分鐘。消毒液：擦拭實(shí)驗(yàn)臺(tái)臺(tái)面。玻片缸：浸泡用過(guò)的載玻片。,

6、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合性實(shí)驗(yàn)一,膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)（P2）培養(yǎng)基的制備P2消毒與滅菌P5細(xì)菌的人工培養(yǎng)無(wú)菌技術(shù)（錄像）擺斜面，傾注平板。,常見(jiàn)病原性球菌的檢查程序P47： 直接涂片、革蘭染色、鏡檢膿汁、痰、咽部分泌物 觀察菌落性狀、溶血性、色素 血瓊脂平板培養(yǎng)

7、涂片染色鏡檢 挑取可疑菌落 生化反應(yīng) ↑ 純培養(yǎng) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 藥敏實(shí)驗(yàn)血液、穿刺液 → 肉湯增菌培養(yǎng) → 培養(yǎng)液

8、涂片染色境檢 常見(jiàn)腸道致病菌的檢查程序P48：糞便 → SS瓊脂、伊紅美藍(lán)平板培養(yǎng) → 挑取可疑菌落 ↑ ↓ 血清學(xué)鑒定 血、骨髓 → 增菌培養(yǎng) 雙糖鐵培養(yǎng)基 染色鏡檢 生化反應(yīng),,,,,,從培養(yǎng)基的制備

9、，細(xì)菌的分離、純化、形態(tài)學(xué)檢查，到細(xì)菌的生化試驗(yàn)、血清學(xué)試驗(yàn)和藥敏試驗(yàn)，全都由同學(xué)們親自動(dòng)手操作和完成。綜合性實(shí)驗(yàn)是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，一個(gè)步驟，一個(gè)環(huán)節(jié)的失誤，將直接影響到最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按要求操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要及時(shí)觀察，及時(shí)記錄，以便撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)論文。,培養(yǎng)基的制備,,※公共培基，勿作標(biāo)記！,1500W電爐▲安全警告培養(yǎng)基沸騰溢出→流入電爐：①觸電→危及生命?、诙搪贰鷶嚯?。,分裝,包裝,量筒,錐形瓶,砝碼,干粉培養(yǎng)基,

10、試管筐,天平,邊臺(tái)柜子內(nèi)器材,錐形瓶用后洗凈、包扎。器材用后放回原處，依次擺整齊。,邊臺(tái)抽屜內(nèi)器材：試管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋,尺子。藥勺、吸管用后洗凈、甩干，放回原處。,稱量紙置于左盤(pán)，游碼移至標(biāo)尺左端“0”點(diǎn)位置上，指針應(yīng)對(duì)準(zhǔn)中線，取得平衡。否則將杠桿兩端的調(diào)整螺母旋動(dòng)調(diào)節(jié)平衡。,秤物時(shí)“左物右碼”，物品在左盤(pán)上，砝碼在右盤(pán)，盡可能放在秤盤(pán)中心。天平保持干燥、清潔。,培養(yǎng)基制備,培養(yǎng)

11、基制備程序： 干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙，牛皮紙，用橡皮筋扎好 →放入講臺(tái)邊的高壓滅菌桶或高壓滅菌筐內(nèi)→送到高壓滅菌室（洗刷室）。請(qǐng)?jiān)?30分鐘內(nèi)完成。,,,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基是用人工的方法，將多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，根據(jù)各種微生物生長(zhǎng)繁殖的需要而合成的一種營(yíng)養(yǎng)制品。它的主要成分是蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉和水，pH7.4～7.6。培養(yǎng)基制備的一般程序： ①調(diào)配→溶化→ 矯正pH →分裝→滅菌

12、→檢定→保存。 ②干粉培養(yǎng)基→蒸餾水→加熱溶化→分裝→滅菌→檢定 →保存。培養(yǎng)基的制備原則： (1)適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)成分,(2)合適的酸堿度,(3)配制后必須滅菌。,培養(yǎng)基的種類（按物理性狀分類）液體培養(yǎng)基:不含凝固劑（瓊脂），用于增菌，純培養(yǎng),保種。固體培養(yǎng)基:含1％～2％瓊脂，用于分離培養(yǎng),純培養(yǎng),保種。半固體培基:含0.3％～0.5％瓊脂，用于動(dòng)力檢測(cè),保種。,液體培養(yǎng)基 固體斜面

13、培養(yǎng)基 半固體高層培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的種類（按用途分類）P3基礎(chǔ)培養(yǎng)基:含一般細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的基本營(yíng)養(yǎng)成分，可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分，如普通平板。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入血液、生長(zhǎng)因子等特殊成分，供營(yíng)養(yǎng)要求較高的細(xì)菌和須要特殊生長(zhǎng)因子的細(xì)菌生長(zhǎng)，如血平板。增菌培養(yǎng)基：促進(jìn)目的菌的生長(zhǎng)，適用于含菌量較少的標(biāo)本，如葡萄糖肉湯。選擇培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入抑制劑抑制雜菌生長(zhǎng)，有助于目的菌的生長(zhǎng)，如EMB、SS

14、平板。鑒別培養(yǎng)基：利用細(xì)菌分解能力及代謝產(chǎn)物的不同，在培養(yǎng)基中加入特定的作用底物和指示劑，用來(lái)試驗(yàn)細(xì)菌的生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物，如糖發(fā)酵管。厭氧培養(yǎng)基：氧化還原電勢(shì)低，表面用凡士林、石蠟封住，與空氣隔絕，成為無(wú)氧環(huán)境，如庖肉培養(yǎng)基。,培養(yǎng)基的滅菌,在冷空氣完全排盡的情況下，蒸汽壓103.43 kPa ,溫度可達(dá)到121.3℃ ,維持15-30分鐘，可以殺滅包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物?；A(chǔ)培養(yǎng)基：121℃高壓蒸汽滅菌15～30分鐘。

15、含糖培養(yǎng)基：115℃滅菌15分鐘。雞蛋、牛奶培養(yǎng)基:75～100℃間歇滅菌3次(1天1次)。不耐高溫的液體成分：濾菌器濾過(guò)除菌（EK型蔡氏濾器、 G5或G6玻璃濾器、0.45um或0.22um微孔濾膜）,,培養(yǎng)基滅菌以后，冷卻50～60℃（溫度越高，冷凝水越多，越易污染 ），以無(wú)菌操作，傾注平皿10ml（直徑7厘米平皿），瓊脂凝固后形成瓊脂平板。 平板主要用于細(xì)菌的分離培養(yǎng)和藥敏試驗(yàn)。,平板儲(chǔ)存待用或做細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，為什么要倒置

16、？①防止平板水分蒸發(fā)丟失。②防止冷凝水滴于平板表面，影響單菌落形成。 ③……,培養(yǎng)基滅菌以后，趁熱斜放，培基不超過(guò)試管長(zhǎng)度的2/3，瓊脂凝固以后形成一個(gè)傾斜的表面。 斜面主要用于純菌移種和菌種保存。 斜面底部的冷凝水有利于純菌移種、菌苔形成和菌種保藏。,怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格?,★無(wú)菌試驗(yàn)：將待檢培養(yǎng)基置于35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)，無(wú)任何細(xì)菌生長(zhǎng)為合格?！镄Ч囼?yàn)：將已知的標(biāo)準(zhǔn)參考菌株，接種于待檢培養(yǎng)

17、基中，檢查細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖狀況和生化反應(yīng)是否與預(yù)期的結(jié)果相符合。,臥式圓形壓力蒸汽滅菌器,YXQ.WY21D,滅菌器主要由滅菌室、管道系統(tǒng)、電器系統(tǒng)和蒸汽發(fā)生器構(gòu)成。蒸汽發(fā)生器電壓380伏，功率12千瓦。滅菌室結(jié)構(gòu)采用雙層單門(mén)不銹鋼制造，兩層之間為夾層。鍋爐的蒸汽通過(guò)管道直接進(jìn)入夾層，儲(chǔ)存高溫飽和蒸汽，預(yù)熱滅菌室。經(jīng)電磁閥控制進(jìn)入滅菌室。滅菌室的冷空氣通過(guò)冷凝閥以冷凝水的形式排出。,滅菌器的設(shè)置,安全閥：當(dāng)蒸汽壓力超過(guò)最高允許

18、使用壓力時(shí)能自動(dòng)跳起，釋放超壓蒸汽，確保安全使用。壓力表：滅菌室和蒸汽套層各裝有壓力表一只，能指示各層內(nèi)的蒸汽工作壓力。溫度表：能隨時(shí)顯示滅菌室內(nèi)最低滅菌溫度，有利操作。冷凝水泄出器：能將滅菌室內(nèi)的冷空氣和冷凝水在滅菌過(guò)程中予以排出，確保滅菌效果。安全聯(lián)鎖裝置：滅菌室壓力降到零，蜂鳴器聲響，提示可以安全開(kāi)門(mén)。,高壓蒸汽滅菌器的操作程序,冷空氣的排除：滅菌室壓力升至0.07MPa時(shí)，關(guān)進(jìn)汽閥，開(kāi)排汽閥，使壓力降到零 ，排汽一次。然

19、后關(guān)排汽閥，開(kāi)進(jìn)汽閥，重復(fù)以上操作。如此反復(fù)三次，方可排凈冷空氣。冷空氣的排除是滅菌成功和失敗的關(guān)鍵。物品的滅菌：一般維持15～30分鐘。排除蒸汽。滅菌物品的干燥（根據(jù)需要）。,★熱蒸汽比冷空氣大概輕一倍，浮在上層，把冷空氣擠壓到底部，經(jīng)排氣管道排出。,高壓蒸汽滅菌器,冷氣出口,蒸汽入口,熱氣流,冷氣流,常用蒸汽壓力與相應(yīng)溫度,壓力(磅/吋） 壓力（Kpa） 相對(duì)溫度(℃) 8 55.16

20、 112.6 10 68.95 115.2 15 103.43 121.3 20 137.90 126.2★1標(biāo)準(zhǔn)大氣壓=76厘米汞柱高=1.013×105帕斯卡=14.696磅/英寸2?！锊捎?000個(gè)大氣壓也不能殺死細(xì)菌，真正起殺菌作用是高溫。,滅菌所需時(shí)間、壓力與溫度指標(biāo),滅菌物品類

21、滅菌時(shí)間(分) 蒸汽壓力Mpa 相對(duì)溫度℃含糖培養(yǎng)基： 15 0.07 115基礎(chǔ)培養(yǎng)基： 15～30 0.11 121橡 膠 類 15 0.11 121敷 料 類 30～45 0.11～0.14 121～126器 皿 類 15 0.11～0.14 121～12

22、6器 械 類 10 0.11～0.14 121～126瓶裝溶液類 20～40 0.11～0.14 121～126,細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的方式和速度,細(xì)菌繁殖方式：以二分裂方式進(jìn)行無(wú)性繁殖。繁殖速度：多數(shù)20～30分鐘繁殖1代，結(jié)核桿菌18～20小時(shí)繁殖一代。細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖曲線,細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線,細(xì)菌數(shù)目的對(duì)數(shù),培養(yǎng)時(shí)間（小時(shí)）,5 10 15

23、 20 25 30,,,活菌數(shù),總菌數(shù),遲緩期,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,穩(wěn)定期,衰退期,細(xì)菌生長(zhǎng)曲線意義,遲緩期：一般1～4h，細(xì)菌代謝活躍，但不繁殖。對(duì)數(shù)期：維持4 ～8h，細(xì)菌快速繁殖，數(shù)目呈幾何級(jí)數(shù)增加，細(xì)菌形態(tài)、染色性、生理活性最典型、對(duì)抗生素最敏感。細(xì)菌鑒定選用此期為佳。穩(wěn)定期： 通常維持10h，活菌數(shù)和死菌數(shù)幾乎相等，代謝產(chǎn)物形成較多。衰亡期：培養(yǎng)18 ～24 h以后，代謝逐漸停滯,死菌數(shù)超過(guò)活

24、菌數(shù)。,常用玻璃器材的處理程序（示教）,新購(gòu)置的玻璃器材：1％～2％鹽酸浸泡過(guò)夜→中和游離堿 →流水沖洗15次→晾干→包裝→滅菌 。無(wú)污染器皿:洗滌劑洗刷→…。病原菌污染的器材（消毒、滅菌后再處理）：試管、吸管和平皿：高壓蒸汽滅菌→趁熱倒出污物→洗滌劑浸泡→瓶子、試管、吸管用毛刷，平皿用紗布洗刷干凈→…。吸管：3％來(lái)蘇兒浸泡過(guò)夜→…。載玻片：3％來(lái)蘇兒浸泡過(guò)夜→ 肥皂水煮沸10min →…。,玻璃器材洗干凈的標(biāo)準(zhǔn),1.洗滌時(shí)觀

25、察:洗后的玻璃器材附著在內(nèi)壁上的水不是個(gè)別水珠,而是一層極薄的水膜。2.干燥后觀察:對(duì)著光亮處觀看玻璃器材,非常透明, 內(nèi)外壁上不出現(xiàn)大片發(fā)白或白點(diǎn),也無(wú)微小污點(diǎn)和粉末。,思考題,人工培養(yǎng)細(xì)菌需要提供的條件是什么? 培養(yǎng)基制備的原則是什么?怎樣檢查培養(yǎng)基是否合格? 培養(yǎng)基按物理形狀分哪幾種?各有何用途?高壓蒸汽滅菌法、紫外線、碘酒的殺菌機(jī)理各是什么?,醫(yī)學(xué)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)綜合性實(shí)驗(yàn)一,膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)（一）培養(yǎng)基

26、的制備P2消毒與滅菌P5細(xì)菌的人工培養(yǎng)無(wú)菌技術(shù)（錄像）擺斜面，傾注平板。,量筒,錐形瓶,砝碼,干粉培養(yǎng)基,試管筐,天平,邊臺(tái)柜子內(nèi)器材,錐形瓶用后洗凈、包扎。器材用后放回原處，依次擺整齊。,邊臺(tái)抽屜內(nèi)器材：試管（棉塞），刻度吸管，洗耳球，稱量紙，藥勺，硫酸紙、牛皮紙、橡皮筋,厘米尺。藥勺、吸管用后洗凈、甩干，放回原處。,常用器材擺放順序：電源插座→試管架→酒精燈→污物盤(pán)。試管架上器材：按接種針、接種環(huán)、油性筆和打火