家蠶bmo-mir-34對(duì)bme74基因表達(dá)的調(diào)控

1、江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)（ＪｉａｎｇｓｕＪｏｆＡｇｒＳｃｉ），２０１６，３２（１）：５１～５７ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｊｓｎｙｘｂｃｏｍ王欣，范洋洋，陳晨，等家蠶ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４對(duì)ＢｍＥ７４基因表達(dá)的調(diào)控［Ｊ］江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，２０１６，３２（１）：５１?５７ｄｏｉ：１０３９６９／ｊｉｓｓｎ１０００?４４４０２０１６０１００８家蠶ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４對(duì)ＢｍＥ７４基因表達(dá)的調(diào)控王欣１，２，范洋洋１，２，陳晨１，２，謝雨辰１，２，蔣濤１，２，汪生鵬１，２，

2、沈興家１，２（１江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇鎮(zhèn)江２１２０１８；２中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江２１２０１８）收稿日期：２０１５?０４?０９基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（３１１７２２６６／Ｃ１７０３）；江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（ＣＸＺＺ１２＿０７２６）作者簡(jiǎn)介：王欣（１９８４?），女，河北唐山人，博士研究生，主要從事家蠶分子生物學(xué)研究。（Ｔｅｌ）０５１１?８５６０１０５２；（Ｅ?ｍａ

3、ｉｌ）ｗａｎｇ７ｘｉｎ２３＠ｙｅａｈｎｅｔ通訊作者：沈興家，（Ｔｅｌ）０５１１?８５６０１０５２；（Ｅ?ｍａｉｌ）ｓｈｅｎｘｊｓｒｉ＠１６３ｃｏｍ摘要：為了研究家蠶ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４（一類高度保守的ｍｉＲＮＡ）對(duì)Ｅ７４基因（ＢｍＥ７４）的表達(dá)調(diào)控作用，首先利用生物信息學(xué)軟件ＲＮＡｈｙｂｒｉｄ和ＲＮＡ２２進(jìn)行結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)，然后從家蠶絲腺組織中克隆了ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４前體序列，分別構(gòu)建ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４表達(dá)載體和靶基因ＢｍＥ７４３′Ｕ

4、ＴＲ重組表達(dá)載體，利用雙報(bào)告基因熒光檢測(cè)系統(tǒng)在細(xì)胞水平研究ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４對(duì)ＢｍＥ７４基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，ＢｍＥ７４３′ＵＴＲ具有ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４潛在結(jié)合位點(diǎn)；體外轉(zhuǎn)染試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４重組質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性極顯著下調(diào)（Ｐ＜００１），但是當(dāng)加入人工合成的ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４抑制物后熒光素酶活性顯著上調(diào)（Ｐ＜００１）。說(shuō)明ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４對(duì)ＢｍＥ７４的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)具有

5、抑制作用。關(guān)鍵詞：ｍｉＲ?３４；家蠶；ＢｍＥ７４基因；表達(dá)調(diào)控中圖分類號(hào)：Ｓ８８１２；Ｑ７８文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：１０００?４４４０（２０１６）０１?００５１?０７ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＢｍＥ７４ｇｅｎｅｂｙｂｍｏ?ｍｉＲ?３４ｉｎＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉＷＡＮＧＸｉｎ１，２，ＦＡＮＹａｎｇ?ｙａｎｇ１，２，ＣＨＥＮＣｈｅｎ１，２，ＸＩＥＹｕ?ｃｈｅｎ１，２，ＪＩＡＮＧＴａｏ１，２，ＷＡＮＧＳｈｅｎｇ?ｐｅｎｇ１，２

6、，ＳＨＥＮＸｉｎｇ?ｊｉａ１，２（１ＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｃｈｏｏｌｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＪｉａｎｇｓｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ２１２０１８，Ｃｈｉｎａ；２ＳｅｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳ

7、ｃｉｅｎｃｅｓ，Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ２１２０１８，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｍｏ?ｍｉＲ?３４（ａｈｉｇｈｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄｍｉＲＮＡ）ｏｎＢｍＥ７４ｇｅｎｅｉｎＢｏｍｂｙｘｍｏｒｉ，ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｏｆｔｗａｒｅｓＲＮＡｈｙｂｒｉｄａｎｄＲＮＡ２２ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｉｄｅｎｔｉｆｙｔｈｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｉｎＢｍＥ７４３′ＵＴＲＰ

8、ｒｅｃｕｒｓｏｒｂｍｏ?ｍｉＲ?３４ｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓｃｌｏｎｅｄａｆｔｅｒｗａｒｄｓ，ａｎｄｂｍｏ?ｍｉＲ?３４ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒａｎｄＥ７４３′ＵＴＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｆｏｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｓｓａｙＤｕａｌ?ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅｒｅｐｏｒｔｅｒｇｅｎｅｓｙｓｔｅｍｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｒｏｌｅｏｆｂｍｏ?ｍ

9、ｉＲ?３４ｉｎｔｈｅｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＢｍＥ７４ｇｅｎｅａｔｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｌｅｖｅｌＴｈｅｐｒｅｄｉｃｔｅｄｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｒｅｗｅｒｅｂｍｏ?ｍｉｒ?３４ｐｏｔｅｎｔｉａｌｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅｓｏｎＥ７４３′ＵＴＲＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｅｘｐｅｒｉ?ｍｅｎｔｓｉｎｖｉｔｒｏｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｃｏ

10、ｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｔｈｅｌｕｃｉｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｔｈｅＢｍＮｃｅｌｌｓｃｏ?ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｂｍｏ?ｍｉＲ?３４ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ（Ｐ＜００１），ａｎｄａｓｃｅｎｄｅｄｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙａｆｔｅｒｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｓｙｎ?ｔｈｅｔｉｃｂｍｏ?ｍｉＲ?３４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐ＜００１）Ｉｔｉｓｉ

11、ｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｂｍｏ?ｍｉＲ?３４ｉｎｈｉｂｉｔｓＥ７４ｇｅｎｅｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎＫｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｉＲ?３４；Ｂｏｍｂｙｘｍｏｒｉ；ＢｍＥ７４ｇｅｎｅ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ家蠶是一種經(jīng)典的生物學(xué)、遺傳學(xué)模式昆蟲(chóng)，近年來(lái)已有家蠶ｍｉＲＮＡｓ方面的研究報(bào)道，包括ｍｉＲＮＡｓ的鑒定、表達(dá)譜分析以及功能預(yù)測(cè)等［１?６］。到２０１４年６月為止，ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／

12、ｗｗｗｍｉｒｂａｓｅ１５表１引物序列Ｔａｂｌｅ１Ｌｉｓｔｏｆｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ引物名稱引物序列（５′?３′）ＲＴＰｒｉｍｅｒＧＴＣＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＴＧＧＡＴＡＣＧＡＣＣＡＡＣＣＡＦｏｒｗａｒｄＰｒｉｍｅｒｇｇｇｇＴＧＧＣＡＧＴＧＴＧＧＴＴＡＧＲｅｖｅｒｓｅＰｒｉｍｅｒＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴｐｒｉ?ｍｉＲ?３４?ＦｃｃｃａａｇｃｔｔＡＧＴＴＡＴＧＴＴＡＧＡＴＧＴＴＧＣＴＣ

13、Ｃｐｒｉ?ｍｉＲ?３４?ＲｃｇｇｇａｔｃｃＣＣＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＥ７４?３′ＵＴＲ?ＦｇｇｇｃｔｃｔａｇａＣＧＣＣＴＣＧＴＣＴＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴＥ７４?３′ＵＴＲ?ＲｇｃｇｇｃｃｇｇｃｃＣＧＴＴＧＧＣＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＣＡＧＴＡ未劃線小寫字母表示保護(hù)堿基的位置，下劃線標(biāo)記部分ｃａａｇｃｔｔ、ｇｇａｔｃｃ、ｔｃｔａｇａ和ｇｇｃｃｇｇｃｃ分別為ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ、ＸｂａⅠ、ＦｓｅⅠ限制性酶切位點(diǎn)。１２３ｂｍｏ?

14、ｍｉＲ?３４的克隆與鑒定提?。谍g３ｄ家蠶幼蟲(chóng)的絲腺組織總ＲＮＡ，以ｍｉＲＮＡｓ反轉(zhuǎn)錄引物（ＲＴＰｒｉｍｅｒ）合成的ｃＤＮＡ為模板進(jìn)行ＰＣＲ。反應(yīng)條件：９４℃５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，６８℃２５ｓ，７２℃３０ｓ，共３４個(gè)循環(huán)；７２℃１０ｍｉｎ。ＰＣＲ產(chǎn)物經(jīng)４％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以ＤＬ２０００作為Ｍａｒｋｅｒ，回收７０ｂｐ片段；連接ｐＭＤｌ８?Ｔ載體，１６℃連接過(guò)夜后轉(zhuǎn)化至ＥｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ；提取重組質(zhì)粒ｐＭＤｌ８?Ｔ?ｍｉＲ?３４，進(jìn)行

15、酶切電泳和測(cè)序鑒定。１２４重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建重組載體Ｔ?ｐｒｉ?ｍｉＲ?３４和ｐｃＤＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ＳＶ４０］分別用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨＩ進(jìn)行雙酶切，將目的片段回收后連接到線性化的ｐｃＤＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ＳＶ４０］上，構(gòu)建重組表達(dá)載體ｐｃＤＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ｐｒｉ?ｍｉＲ?３４?ＳＶ４０］。重組載體Ｔ?Ｅ７４?３′ＵＴＲ和ｐＧＬ３０［Ａ３?ｌｕｃ?ＳＶ４０］分別用ＸｂａⅠ和ＦｓｅⅠ進(jìn)行雙酶切，將目的片段回

16、收后連接到線性化的ｐＧＬ３０［Ａ３?ｌｕｃ?ＳＶ４０］上，構(gòu)建重組表達(dá)載體ｐＧＬ３０［Ａ３?ｌｕｃ?Ｅ７４?３′?ＵＴＲ?ＳＶ４０］。１２５ＢｍＮ細(xì)胞的轉(zhuǎn)染將ｐｃＤＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ＳＶ４０］、ｐＧＬ３０［Ａ３?ｌｕｃ?Ｅ７４?３′?ＵＴＲ?ＳＶ４０］、ｐｃＤＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ｐｒｉ?ｍｉＲ?３４?ＳＶ４０］、ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ和內(nèi)參質(zhì)粒ｐＲＬ?ＣＭＶ分成３組分別進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。第１組：ｐＧＬ３

17、０［Ａ３?ｌｕｃ?Ｅ７４?３′?ＵＴＲ?ＳＶ４０］、ｐｃＤ?ＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ＳＶ４０］和ｐＲＬ?ＣＭＶ３種質(zhì)粒；第２組：ｐＧＬ３０［Ａ３?ｌｕｃ?Ｅ７４?３′?ＵＴＲ?ＳＶ４０］、ｐｃＤＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ｐｒｉ?ｍｉＲ?３４?ＳＶ４０］和ｐＲＬ?ＣＭＶ３種質(zhì)粒；第３組：ｐＧＬ３０［Ａ３?ｌｕｃ?Ｅ７４?３′?ＵＴＲ?ＳＶ４０］、ｐｃＤＮＡ３０［ｉｅ１?ｅｇｆｐ?ｐｒｉ?ｍｉＲ?３４?ＳＶ４０］、ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４

18、ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ和ｐＲＬ?ＣＭＶ４種質(zhì)粒。每組中的質(zhì)粒濃度稀釋至２００ｎｇ／μｌ并按１∶１的比例混合。將密度為１ｍｌ１０１０６～１５１０６細(xì)胞的ＢｍＮ細(xì)胞接種到１２孔培養(yǎng)板中，２７℃培養(yǎng)過(guò)夜。轉(zhuǎn)染參照文獻(xiàn)［１６］、［１７］的方法進(jìn)行，將３μｌ上述質(zhì)?；旌衔锖停郸蹋欤茫澹欤欤妫澹悖簦椋睿颍澹幔纾澹睿舴謩e加入到５０μｌ無(wú)血清ＴＣ?１００培養(yǎng)基中配置轉(zhuǎn)染液，輕輕混勻后室溫孵育２０ｍｉｎ。轉(zhuǎn)染前吸去１２孔細(xì)胞培養(yǎng)板中帶血清的完全培養(yǎng)基，并用無(wú)

19、血清ＴＣ?１００培養(yǎng)基輕輕清洗細(xì)胞２次。將溫育后的轉(zhuǎn)染液加入到清洗過(guò)的ＢｍＮ細(xì)胞中，２７℃轉(zhuǎn)染５ｈ后除去轉(zhuǎn)染液，加入完全培養(yǎng)基２７℃繼續(xù)培養(yǎng)，４８ｈ后進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。１２５螢光素酶活性檢測(cè)熒光素酶活性的檢測(cè)按照Ｐｒｏｍｅｇａ試劑盒雙熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)操作手冊(cè)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染４８ｈ后，吸去細(xì)胞培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液，每孔中加入２５０μｌ１ＰａｓｓｉｖｅＬｙｓｉｓＢｕｆｆｅｒ（１ＰＬＢ），使細(xì)胞充分裂解，將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)到１５ｍｌ離心管中，１

20、２０００ｒ／ｍｉｎ離心３０ｓ，吸取上清至新的１５ｍｌ離心管中。?。处蹋旒?xì)胞裂解液加入含有２０μｌＬｕｃｉｆｅｒａｓｅＡｓｓａｙＲｅａｇｅｎｔＩＩ（ＬＡＲＩＩ）的檢測(cè)管中混勻，檢測(cè)管放入Ｐｒｏｍｅｇａ熒光素酶檢測(cè)儀（２０／２０ｎＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ，ＴｕｒｎｅｒＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）中檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光強(qiáng)度。加入２０μｌＳｔｏｐ＆ＧｌｏＴＭ，檢測(cè)海參熒光素酶活性，記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。２結(jié)果２１ｂｍｏ?ｍｉＲ?３４與ＢｍＥ７４基因結(jié)合位點(diǎn)的