苯中毒的骨髓造血細胞microRNA表達譜與miR-34a-5p對苯毒性的調(diào)控研究.pdf

1、研究背景與目的:
　　苯暴露可導致機體產(chǎn)生造血毒性，導致造血系統(tǒng)疾病的發(fā)生，其毒性機制主要是抑制骨髓造血干細胞的增殖與分化功能。miRNA是一類非編碼小分子RNA，參與多種生理和病理過程的調(diào)控，包括造血干細胞的自我更新、分化和造血微環(huán)境間的調(diào)控。最近的研究發(fā)現(xiàn)特定的miRNA與外源性有害物質(zhì)暴露產(chǎn)生的毒性作用之間具有相關(guān)性，但是miRNA在苯暴露導致的骨髓造血細胞中的調(diào)控作用并不清楚。本研究通過構(gòu)建苯中毒小鼠模型，在骨髓Lin-細

2、胞水平對苯中毒導致的miRNA差異表達譜進行分析，并驗證差異表達的造血相關(guān)miRNA在骨髓造血祖細胞(Lin-c-Kit+)水平的表達。通過苯暴露導致的骨髓造血細胞miRNA差異表達譜結(jié)合苯暴露后小鼠骨髓造血細胞的差異蛋白表達譜對造血相關(guān)miRNA進行miRNA-mRNA共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析，篩選出miR-34a-5p在其中發(fā)揮主要調(diào)控作用;構(gòu)建miR-34a-5p過表達和表達抑制的K562細胞模型，在此基礎(chǔ)上研究miR-34a-5p在1

3、，4-BQ對K562細胞毒性中發(fā)揮的生物學功能;在K562細胞中識別并驗證miR-34a-5p的靶基因，研究miR-34a-5p的靶基因在1，4-BQ對K562細胞毒性中發(fā)揮的調(diào)控作用;研究miR-34a-5p在病例組和對照組人群中的表達水平，為苯中毒機制及生物標志提供新的科學線索和依據(jù)。
　　第一章苯中毒小鼠骨髓造血細胞的miRNA表達譜
　　以雄性C57BL/6小鼠為實驗對象，采用皮下注射的方式進行染毒，苯染毒組濃度為1

4、50 mg/(kg-b.w.)，每周染毒5天，連續(xù)染毒4周，對照組小鼠皮下注射同等劑量的食用調(diào)和油。染毒結(jié)束后對小鼠的一般毒性和造血毒性進行評價，其中一般毒性包括體重和臟器系數(shù)，造血毒性包括血常規(guī)、造血干細胞比例和骨髓細胞內(nèi)ROS水平。結(jié)果顯示苯染毒可導致小鼠體重和胸腺體比顯著降低(p＜0.05)。外周血檢測結(jié)果顯示苯染毒組小鼠外周血白細胞、紅細胞、淋巴細胞明顯低于對照組(p＜0.05)。流式細胞儀檢測骨髓中造血細胞比例的結(jié)果表明苯暴露

5、可導致骨髓Lin-c-Kit+細胞和造血干細胞(Lin-c-KitSca-1+)的比例明顯低于對照組(P＜0.05)。苯染毒組小鼠骨髓中造血干細胞的ROS水平明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　在上述苯中毒小鼠模型基礎(chǔ)上，通過流式細胞儀分選出骨髓Lin-細胞，提取RNA后進行Illumina測序篩選出與苯暴露相關(guān)的miRNA差異表達譜。與陰性對照組小鼠相比，苯中毒組小鼠骨髓Lin-細胞中有45個miRNA表達下調(diào)

6、，5個miRNA表達上調(diào)。
　　第二章苯中毒造血相關(guān)差異表達miRNA的篩選及信號通路富集分析
　　應(yīng)用qRT-PCR在骨髓Lin-細胞水平對8個造血相關(guān)miRNA(mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451 a、mmu-miR-144-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181 a-5p)的表達水平進行檢

7、測并驗證。結(jié)果顯示，qRT-PCR與Illumina測序的結(jié)果一致，即苯暴露可導致骨髓Lin-細胞中mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-129b-5p、mmu-miR-451a和mmu-miR-144-5p的表達上調(diào)，mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181 a-5p的表達下調(diào)。進一步在骨髓Lin-c-Kit+細胞水平對差異表達的造血相關(guān)miRNA的表達

8、進行檢測。結(jié)果顯示，苯暴露可導致mmu-miR-34a-5p、mmu-miR-342-3p、mmu-miR-196b-5p、mmu-miR-100-5p和mmu-miR-181a-5p的表達在骨髓Lin-c-Kit+細胞水平發(fā)生改變，表達趨勢與骨髓Lin-細胞一致。
　　通過比對上述8個造血相關(guān)miRNA在人和小鼠中的序列，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p、miR-451a、miR-100-5p、miR-181a-5p、miR-196b-

9、5p和miR-342-3p在人和小鼠中具有同源性。通過靶基因預(yù)測軟件結(jié)合苯暴露后小鼠骨髓造血細胞的差異蛋白表達譜的結(jié)果對造血相關(guān)miRNA的靶基因進行分析，利用DAVID在線分析數(shù)據(jù)庫對靶基因參與的KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示這些靶基因主要參與的信號通路有鈣信號轉(zhuǎn)導通路、促性腺激素釋放激素信號通路、卵母細胞減數(shù)分裂、長時程增強、細胞骨架調(diào)控、ErbB信號傳導途徑、MAPK信號通路、Wnt信號通路和細胞周期。在此基礎(chǔ)上對差異表達的造血相

10、關(guān)miRNA構(gòu)建miRNA-mRNA的共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果提示表達上調(diào)的miR-34a-5p可能通過靶向調(diào)控多種靶基因參與上述信號通路在苯誘導的造血毒性中發(fā)揮主要調(diào)控作用，其次是表達下調(diào)的miR-342-3p和miR-196b-5p。
　　第三章 miR-34a-5p在1，4-BQ致K562細胞毒性中的生物學功能
　　構(gòu)建苯的代謝終產(chǎn)物1，4-BQ暴露的K562細胞模型，采用qRT-PCR方法檢測1，4-BQ染毒K562細胞

11、后miR-34a-5p的表達改變。結(jié)果表明，miR-34a-5p的表達隨著1，4-BQ染毒濃度的增加及染毒時間的延長逐漸增加，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。因此后續(xù)實驗選擇在細胞模型與動物模型一致的miR-34a-5p。同時在該細胞模型上研究1，4-BQ對K562細胞的毒性作用，包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、細胞分化和ROS。細胞增殖的結(jié)果表明隨著1，4-BQ染毒濃度和染毒時間的增加，K562細胞的增殖率逐漸降低。細胞周期的

12、結(jié)果顯示，G0/G1期和G2期細胞比例隨著染毒濃度的增加而降低，S期細胞比例隨著染毒濃度的增加而增加。細胞凋亡的結(jié)果顯示1，4-BQ可顯著增加K562細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系。流式細胞儀檢測1，4-BQ染毒K562.細胞對其向巨核細胞分化的影響，結(jié)果顯示較高濃度1，4-BQ(20μM和40μM)可顯著增加CD41a的表達，促進K562細胞向巨核細胞分化。1，4-BQ染毒K562細胞2h可促使細胞

13、內(nèi)ROS顯著增加。
　　通過qRT-PCR確定miR-34a-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染K562細胞的最佳轉(zhuǎn)染條件。qRT-PCR的結(jié)果表明K562細胞轉(zhuǎn)染30 nM mimic和200 nM inhibitor24h可顯著增加和降低miR-34a-5p的表達(p＜0.05)，因此后續(xù)研究選擇該轉(zhuǎn)染濃度模擬miR-34a-5p過表達和表達抑制在1,4-BQ致K562細胞毒性中的生物學作用。結(jié)果表明，抑制K562細胞中

14、miR-34a-5p的表達可抑制1，4-BQ對K562細胞的增殖毒性作用，如K562細胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p inhibitor后，20μM1，4-BQ染毒組再染毒24h，K562細胞增殖率高于陰性轉(zhuǎn)染組(p＜0.05)。細胞周期的結(jié)果表明，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，K562細胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic后用20μM1，4-BQ染毒24 h可導致K562細胞S期細胞比例增加(p＜0.05)。細胞分化的結(jié)果表明，與陰性轉(zhuǎn)染組相比，在

15、K562細胞中過表達miR-34a-5p可促進20μM1，4-BQ染毒過程中向巨核細胞分化(p＜0.05)。細胞凋亡和ROS的結(jié)果表明，miR-34a-5p對1，4-BQ致K562細胞凋亡和ROS的毒性作用沒有影響。
　　第四章 miR-34a-5p在1,4-BQ致K562細胞毒性中的調(diào)控機制
　　通過靶基因預(yù)測軟件結(jié)合小鼠苯暴露后骨髓造血細胞的差異蛋白表達譜的結(jié)果及miR-34a-5p可參與調(diào)控K562細胞的細胞周期的結(jié)果

16、，初步篩選出miR-34a-5p的候選靶基因STAG1、STAG2和PCNA。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-34a-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染至K562細胞后，候選靶基因STAG1、STAG2和PCNA在mRNA水平未發(fā)生明顯改變。Western blot檢測結(jié)果表明在K562細胞中高表達miR-34a-5p可抑制STAG1和STAG2的蛋白表達，抑制miR-34a-5p的表達可促進STAG1和STAG2的蛋白表達，且差異

17、具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，改變K562細胞中miR-34a-5p的表達對PCNA的蛋白表達沒有影響。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鬟^表達miR-34a-5p可導致含有野生型STAG13'UTR和STAG23'UTR的熒光素酶活性下降(p＜0.05)，說明miR-34a-5p可通過與STAG1和STAG2的3'UTR區(qū)結(jié)合直接靶向調(diào)節(jié)STAG1和STAG2。
　　為了進一步研究miR-34a-5p在miR-34a-5p在1，4-B

18、Q致K562細胞毒性中的調(diào)控機制，Western blot檢測了miR-34a-5p的靶基因在1，4-BQ染毒K562細胞過程中的表達改變。結(jié)果表明與陰性轉(zhuǎn)染組相比，K562細胞轉(zhuǎn)染miR-34a-5p mimic24 h可顯著降低20μM1，4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白表達水平，分別是陰性轉(zhuǎn)染組的0.41和0.79，而轉(zhuǎn)染inhibitor后可顯著增加20μM1，4-BQ染毒24 h后STAG1和STAG2的蛋白

19、表達水平，分別是陰性轉(zhuǎn)染組的1.76和3.18倍，且與陰性轉(zhuǎn)染組對比具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。
　　第五章 miR-34a-5p對職業(yè)苯暴露人群血液毒性的影響
　　收集苯暴露人群外周血樣本，根據(jù)血常規(guī)檢查及復查的白細胞計數(shù)將苯作業(yè)人員分為對照組(WBC≥4.5×109/L)和病例組(WBC＜4.5×109/L)，按年齡和性別進行1∶1配對，每組各35例，研究暴露于同樣苯環(huán)境的對照組和病例組人群外周血中miR-34a-5

20、p的表達是否存在差異。卡方分析的結(jié)果顯示本研究納入的對照組和病例組人群的年齡、性別、吸煙和飲酒都沒有統(tǒng)計學差異(p＞0.05)。qRT-PCR結(jié)果表明病例組人群外周血中miR-34a-5p的表達水平是對照組人群的1.91倍，且具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。因此miR-34a-5p的表達上調(diào)可能與苯暴露導致苯中毒之間具有一定的相關(guān)性。
　　總結(jié)
　　本研究成功構(gòu)建苯中毒小鼠模型，結(jié)果表明苯對造血系統(tǒng)的毒性作用主要是抑制骨髓造

21、血干細胞的增殖與分化功能。通過Illumina測序發(fā)現(xiàn)苯暴露可導致骨髓Lin-細胞的microRNA表達譜發(fā)生改變。qRT-PCR方法驗證了Illumina測序結(jié)果的準確性，并且驗證了苯暴露可在骨髓Lin-c-Kit+細胞水平導致造血相關(guān)miRNA的表達發(fā)生改變。通過苯暴露骨髓Lin-c-Kit+細胞中異常表達的miRNA與差異蛋白表達譜構(gòu)建miRNA-mRNA共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p可能通過鈣信號轉(zhuǎn)導通路、卵母細胞

22、減數(shù)分裂、ErbB信號傳導途徑、Wnt信號通路、MAPK信號通路和細胞周期等信號通路參與苯誘導的造血毒性。
　　通過構(gòu)建miR-34a-5p過表達和表達抑制的K562細胞模型，結(jié)果表明miR-34a-5p可與細胞周期信號通路相關(guān)基因STAG1和STAG2的3'UTR區(qū)結(jié)合，在蛋白水平調(diào)控STAG1和STAG2的表達，從而影響K562細胞的細胞周期分布。進一步通過1，4-BQ染毒miR-34a-5p過表達和表達抑制的K562細胞，結(jié)

23、果表明抑制K562細胞中miR-34a-5p的表達可抑制1，4-BQ對K562細胞的增殖毒性作用。miR-34a-5p可通過調(diào)控STAG1和STAG2的蛋白表達影響1，4-BQ染毒過程中K562細胞的細胞周期分布，從而影響苯及其代謝終產(chǎn)物誘導的造血毒性作用。
　　與對照組人群相比，miR-34a-5p在病例組人群外周血中呈表達上調(diào)趨勢，說明miR-34a-5p的表達增加可能促進苯暴露人群發(fā)生苯中毒。
　　綜上，本課題首次在骨