典型全氟-多氟磺酸化合物對(duì)大鼠長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的影響和機(jī)制研究.pdf

1、全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)是一種最典型的全氟磺酸化合物，由于良好的表面活性和穩(wěn)定性被廣泛應(yīng)用于日常生活和工業(yè)生產(chǎn)等多個(gè)領(lǐng)域。PFOS能夠通過(guò)血腦屏障對(duì)發(fā)育神經(jīng)系統(tǒng)造成影響，抑制仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力，但其機(jī)制尚不清楚。自2009年P(guān)FOS被列入斯德哥爾摩公約，已在多國(guó)禁止生產(chǎn)使用，但在某些生產(chǎn)領(lǐng)域仍在持續(xù)使用，包括直接向環(huán)境中排放的泡沫滅火劑和殺蟲(chóng)劑。此外，PFOS替代品生產(chǎn)應(yīng)用的快速發(fā)展，使

2、得大量短碳鏈及插入氮、氧等雜原子的全氟/多氟磺酸類(lèi)化合物的環(huán)境水平升高，然而相關(guān)的毒理學(xué)研究極其有限，環(huán)境健康風(fēng)險(xiǎn)未知。研究典型全氟/多氟磺酸化合物的神經(jīng)毒性效應(yīng)和機(jī)制，對(duì)于闡明這類(lèi)污染物與學(xué)習(xí)能力損傷、神經(jīng)退行性疾病之間的關(guān)系具有重要意義。
　　本論文利用整體動(dòng)物建立交叉哺育模型進(jìn)行發(fā)育期暴露，研究PFOS對(duì)反映學(xué)習(xí)記憶能力的關(guān)鍵指標(biāo)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的影響，結(jié)合原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞離體培養(yǎng)，從α-氨基羥甲基惡唑丙酸(AMPA)

3、受體運(yùn)輸調(diào)控探討PFOS暴露引起LTP損傷的潛在機(jī)制。進(jìn)一步對(duì)與學(xué)習(xí)記憶能力密切相關(guān)的Tau磷酸化和β淀粉樣蛋白(Aβ)生成過(guò)程進(jìn)行檢測(cè)，闡明發(fā)育期PFOS暴露與神經(jīng)退行性疾病的可能關(guān)聯(lián)。最后，比較急性側(cè)腦室暴露典型全氟/多氟磺酸化合物對(duì)在體LTP的影響，初步評(píng)價(jià)其神經(jīng)毒性潛能。主要內(nèi)容包括:
　　(1)建立整體動(dòng)物交叉哺育模型，利用電生理技術(shù)測(cè)定PFOS對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)在體LTP的影響，闡明發(fā)育期PFOS暴露損傷學(xué)習(xí)記憶能力的

4、機(jī)制。結(jié)果顯示:發(fā)育期PFOS暴露會(huì)劑量依賴(lài)性抑制LTP的誘發(fā)和維持，與PFOS影響大鼠自發(fā)行為和損傷學(xué)習(xí)記憶能力的結(jié)果一致，為PFOS的發(fā)育神經(jīng)毒性提供了電生理學(xué)依據(jù)。高頻刺激60min后5mg/L和15mg/L PFOS暴露組的場(chǎng)突觸后電位(field-excitatory postsynaptic potential，fEPSP)幅值與對(duì)照組相比降低20-27％。反映基礎(chǔ)突觸傳遞能力的輸入輸出曲線(I/O)刺激強(qiáng)度在0.3-0.5

5、mA時(shí)PFOS處理組fEPSP幅值比對(duì)照組顯著降低，雙脈沖易化效應(yīng)(PPF)在最大易化點(diǎn)TT15組顯著低于對(duì)照組。結(jié)果提示PFOS發(fā)育期暴露會(huì)同時(shí)影響突觸前細(xì)胞和突觸后細(xì)胞的突觸傳遞效率和突觸可塑性，是PFOS損傷學(xué)習(xí)記憶能力的重要機(jī)制。
　　(2)結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)，闡明PFOS損傷LTP的AMPA調(diào)控機(jī)制。PFOS發(fā)育期體內(nèi)暴露引起GluR1和GluR2蛋白和基因的表達(dá)水平下調(diào)，同時(shí)引起磷酸化蛋白GluR1-s831和蛋白

6、激酶CaMKⅡ-α表達(dá)水平下調(diào)。新生仔鼠原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞暴露于2μM和20μM PFOS后，AMPA受體亞基GluR1和GluR2在膜上的表達(dá)降低，與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。PFOS引起谷氨酸作用蛋白GRIP1表達(dá)顯著下調(diào)，與GluR2變化趨勢(shì)一致，RNA剪輯酶ADAR2mRNA表達(dá)比對(duì)照組增加2倍。NBQX抑制PFOS對(duì)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)和相關(guān)基因表達(dá)的影響。結(jié)果說(shuō)明PFOS通過(guò)改變AMPA受體亞基的表達(dá)調(diào)節(jié)AMPA受體的動(dòng)態(tài)分布，提高AMPA受

7、體對(duì)Ca2+的通透性，損傷神經(jīng)突觸可塑性。
　　(3)通過(guò)考察PFOS發(fā)育期暴露對(duì)Tau磷酸化和Aβ聚集水平的影響，闡明PFOS發(fā)育期暴露與神經(jīng)退行性疾病之間的可能關(guān)聯(lián)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):PFOS發(fā)育期暴露引起Tau總蛋白及mRNA表達(dá)水平上調(diào)，引起Tau蛋白在S199、T231、S396位點(diǎn)的磷酸化水平升高以及蛋白激酶GSK-3β蛋白含量顯著上調(diào)。PFOS發(fā)育期暴露促進(jìn)淀粉樣蛋白前體App mRNA的表達(dá)上調(diào)，Aβ1-42表達(dá)增加，早老

8、素Ps-1表達(dá)下調(diào)，引起App剪切過(guò)程異常和Aβ聚集。另外，PFOS血清濃度較低的出生前PFOS暴露組和出生后暴露組及出生前后均暴露組對(duì)Tau磷酸化和Aβ聚集水平的影響程度相當(dāng)，提示胚胎期PFOS暴露具有較高的發(fā)育神經(jīng)毒性。
　　(4)比較典型全氟/多氟磺酸類(lèi)化合物急性側(cè)腦室注射對(duì)在體LTP的影響，研究PFOS替代物的潛在神經(jīng)毒性效應(yīng)和機(jī)制。結(jié)果表明，PFOS替代物均對(duì)LTP產(chǎn)生抑制作用，并隨暴露濃度升高抑制作用增強(qiáng)。高頻刺激后6

9、0 min，對(duì)照組fEPSP幅值仍維持在基線的140％以上，而100μM PFOS、全氟己烷磺酸(PFHxS)和氯代多氟醚基磺酸(C1-PFAES)的fEPSP幅值降低至基線的97％和98％，顯著低于對(duì)照組。全氟丁烷磺酸鉀鹽(PFBS)對(duì)LTP的抑制作用較弱，fEPSP幅值維持在基線的122％，與對(duì)照組無(wú)顯著差異。PFHxS和C1-PFAES對(duì)LTP的損傷程度與PFOS相近，提示PFHxS和C1-PFAES具有與PFOS相當(dāng)?shù)膿p傷神經(jīng)突

10、觸可塑性的潛能。C1-PFAES對(duì)基礎(chǔ)波fEPSP有顯著的抑制作用，提示C1-PFAES可能具有與全氟磺酸類(lèi)化合物不同的神經(jīng)毒性作用機(jī)制。因此有必要進(jìn)一步研究PFOS替代物的發(fā)育神經(jīng)毒性。
　　發(fā)育期PFOS暴露抑制LTP的誘導(dǎo)和維持，AMPA受體調(diào)控是其重要機(jī)制。PFOS通過(guò)抑制蛋白激酶CaMKⅡ-α對(duì)GluR1-s831、GluR2-s880的磷酸化，改變AMPA受體亞基GluR1、GluR2在細(xì)胞膜上的分布，引起AMPA受體