豬苓菌核多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和溶液構(gòu)象研究.pdf

1、豬苓(Polyporus umbellatus)是具有2000多年藥用歷史的名貴珍稀藥用真菌，菌核是其主要的藥用部位。多糖是豬苓菌核的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、護肝等多種重要的生理活性，但在活性功能中扮演重要角色的結(jié)構(gòu)性質(zhì)卻少有報道。本論文對豬苓菌核多糖進行了系統(tǒng)性的研究，包括菌核多糖的提取工藝優(yōu)化；活性均一多糖組分的分離純化制備；活性均一組分的理化特性分析、結(jié)構(gòu)鑒定和溶液構(gòu)象性質(zhì)研究。
　　1.豬苓菌核多糖

2、的提取工藝優(yōu)化研究
　　豬苓菌核多糖超聲輔助提取工藝在單因素的基礎上采用BoxBehnken設計進行響應面優(yōu)化。結(jié)果表明除了超聲功率、提取溫度、提取時間和液料比的明顯的單獨影響作用之外，提取溫度與超聲功率和液料比，液料比與超聲功率和提取時間之間的交互作用對豬苓菌核多糖得率也有顯著的影響。提取工藝參數(shù)的最優(yōu)設置為溫度72.3 ℃，功率304.2 W，液料比22.7 mL/g和提取時間63.6 min，此條件下得到的最大得率為2.48

3、％。
　　2.豬苓菌核多糖的分離純化和理化特性研究
　　豬苓菌核多糖提取液依次使用30、60、80 vol.%的乙醇終濃度分級沉淀，分別得到3個粗組分PUPF30、PUPF60和PUPF80?？紤]到水溶性和抗氧化活性結(jié)果，最終選取PUPF60和PUPF80進一步純化制備均一活性多糖組分。經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow和Sephacryl S系列凝膠柱層析后，分別從PUPF60和PUPF80中得到PUPF6

4、0W、PUPF60S1、PUPF60S2以及PUPF80W、PUPF80S1、PUPF80S2六個均一組分，平均分子量分別為2.09×104 Da、2.27×104 Da、2.44×104 Da、6.5×103 Da、8.8×103 Da、6.0×103 Da。6個組分中除PUPF80S2含有8%以上的蛋白之外均只含少量蛋白，且均具有多糖的特征紅外吸收。糖醛酸存在于鹽洗脫組分PUPF60S1、PUPF60S2、PUPF80S1和PUPF

5、80S2中，含量分別為3.75%、24.20%、10.02%和14.23%。
　　3.豬苓菌核均一多糖組分的結(jié)構(gòu)鑒定
　　6個豬苓菌核均一多糖組分的結(jié)構(gòu)性質(zhì)采用單糖組成分析、甲基化分析、羧基還原等化學方法，結(jié)合氣相、氣質(zhì)聯(lián)用以及1D和2D NMR等儀器分析技術(shù)進行闡述，確定了包括它們的單糖組成、糖殘基鏈接類型和順序、異頭構(gòu)型等結(jié)構(gòu)信息。
　　(1) PUPF60W的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。PUPF60W是支鏈度為74.7%的高度支鏈

6、化多糖，主要由巖藻糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為0.82:1.00:12.25；主要的結(jié)構(gòu)構(gòu)成為主鏈由α-1,6-D-Galp組成，非還原性末端α-D-Galp取代了大約2/3的主鏈殘基的O-2位，具體結(jié)構(gòu)如下：
　　另外結(jié)構(gòu)中也含有少量末端α-L-Fucp、α-1,2,3-D-Galp、α-1,3-D-Glcp等殘基。
　　(2) PUPF60S1的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。PUPF60S1為支鏈度為41.2%的多糖，主要由葡萄糖和半乳

7、糖組成，摩爾比為2.02:1.00，同時也含有極少量的葡萄糖醛酸和巖藻糖；主鏈由α-1,6-D-Galp、α-1,4-D-Glcp、β-1,6-D-Glcp、β-1,3-D-Glcp構(gòu)成，其中部分α-1,6-D-Galp的O-2位鏈接有非還原性末端α-D-Galp，部分β-1,6-D-Glcp的 O-3位鏈接有末端β-D-Glcp、β-1,4-D-Glcp、β-1,3-D-Glcp構(gòu)成的支鏈，具體的結(jié)構(gòu)可能如下：
　　其中，x、y

8、、m、n近似比值為11:5:2:8。另外，少量末端α-L-Fucp、α-1,2,3-D-Galp、α-1,4,6-D-Glcp等殘基可能也存在于主鏈或支鏈中。
　　(3) PUPF60S2的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。PUPF60S2是支鏈度為37.1%的多糖，主要由葡萄糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成；主鏈由β-1,6-D-Glcp構(gòu)成且每隔1個即被支鏈取代于 O-3位，支鏈由末端β-D-Glcp、β-1,4-D-Glcp、β-1,3-D-Glcp、β-1,4

9、-D-GlcpA、β-1,3-D-GlcpA構(gòu)成，具體結(jié)構(gòu)如下：
　　其中，少量的β-1,4-D-GlcpA和β-1,3-D-Glcp分別被它們的對應物β-1,4-D-Glcp和β-1,3-D-GlcpA替代。
　　(4) PUPF80W的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。PUPF80W主要由摩爾比為2.07:1.00的葡萄糖和半乳糖組成，但支鏈度僅為28.5%；主鏈由α-1,6-D-Galp、α-1,4-D-Glcp、β-1,6-D-Glcp、β

10、-1,3-D-Glcp構(gòu)成，其中部分α-1,6-D-Galp的O-2位鏈接有非還原性末端α-D-Galp，部分β-1,6-D-Glcp的O-3位鏈接有末端β-D-Glcp、β-1,3-D-Glcp、α-1,3-D-Glcp構(gòu)成的支鏈，具體的結(jié)構(gòu)可能如下：
　　其中，x、y、z、l、m、n的近似比例為6:3:7:2:10:6。同時結(jié)構(gòu)中可能還含有少量1,2,3-D-Galp和β-1,4-D-Glcp。
　　(5) PUPF80

11、S1的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。PUPF80S1主要由葡萄糖和葡萄糖醛酸構(gòu)成，但支鏈度更低(22.8%)；主鏈除主要由β-1,6-D-Glcp構(gòu)成之外還含有少量β-1,3-D-Glcp，部分β-1,6-D-Glcp的O-3位被支鏈取代，支鏈主要由末端β-D-Glcp、β-1,4-D-Glcp、β-1,3-D-Glcp構(gòu)成。糖醛酸構(gòu)成為β-1,4-D-GlcpA和β-1,3-D-GlcpA兩種殘基，分別部分替代結(jié)構(gòu)中β-1,4-D-Glcp和β-1,3-

12、D-Glcp兩種殘基。PUPF80S1的具體結(jié)構(gòu)如下：
　　其中，部分β-1,4-D-Glcp和β-1,3-D-Glcp分別被對應的β-1,4-D-GlcpA和β-1,3-D-GlcpA所替代。
　　(6) PUPF80S2結(jié)構(gòu)性質(zhì)。PUPF80S2的支鏈度為25.7%，主要單糖單元為葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖，主要的殘基為末端D-Glcp、1,3-D-Glcp、1,4-D-Glcp、1,4-D-GlcpA、1,6-D-Gl

13、cp、1,3,6-D-Glcp等，進一步的結(jié)構(gòu)性質(zhì)需待后續(xù)制備足夠量后進行NMR分析確定。
　　4.豬苓菌核均一多糖的溶液中構(gòu)象研究
　　多檢測器凝膠滲透色譜儀和原子力顯微鏡被用于 PUPF60W、PUPF60S1、PUPF60S2、PUPF80W和PUPF80S1在溶液中的構(gòu)象進行分析。結(jié)果表明溶液中 PUPF60W、PUPF60S1、PUPF80W和PUPF80S1的構(gòu)象為球形鏈，鏈密度分別為0.44、0.28、0.43