pdgf及白介素-10對大鼠肝星形細胞bcl-2／bax的影響

1、2 6 8福建 醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2 0 0 4 年 4月 第 3 8 卷第 2 期 P D G F及 白介 素一 1 0對大 鼠肝 星形 細 胞 b c l 一 2 ／ b a x的影 響張生 君，陳運新 ， 陳治新 ， 王 小眾 摘要 ；目的 探討血小板衍生生長因子( P D G F ) 及 白介素一 1 0 ( I L — i 0 ) 對體外培養(yǎng)的肝星形細胞( H S C) 表達 b c l 一 2 ／ b a x的影響。方法 原位灌

2、流法分離H S C ， 體外培養(yǎng)激活 ， 分為對照組 ( c組) 、 P D GF干預(yù)組( P組) 、 I L 一 1 0干 預(yù)組 ( I 組 ) 及 P D G F和I L 一 1 O 共 同干預(yù) 組 ( T組 ) 。 采 用半 定量 R T — P C R方法 對各 組 細胞 的b c l 一 2 、 b a x在 R N A水 平 的表達進行比較分析 。結(jié)果 P 、 I 及T組b e l 一 2m R N A的表達均 明顯低于c組

3、 ( P 0 ． 0 5 ) 。 P組 、 I 組及T組b a xmR N A的表達均明顯 高 于 C組 ( PO ． 0 5 ) 。結(jié) 論 P D G F的作 用 以促進HS C增 殖 為主 ； I L 一 1 0 能 通過 調(diào)節(jié) b e l 一 2 ／ b a x表達 而促 進HS C凋亡 ， 具有 抑 制 HS C增殖 的作 用 。關(guān)鍵詞 ；白細胞介素一 1 O ； 星形細胞 ； 肝硬化； 基因， b e l 一 2 ； 逆轉(zhuǎn)錄聚

4、合酶鏈反應(yīng)； 肝 ； 大鼠 中圖分類號 ： R3 9 4 ． 2文獻標(biāo)識碼 ： A文章編號： 1 6 7 2 — 4 1 9 4 ( 2 0 0 4 ) 0 2 — 0 2 6 8 — 0 4肝 星 形 細 胞 ( h e p a t i cs t e l l a t ec e l l s ， H S C) 是 肝 臟 細 胞外 基質(zhì) ( e x t r a c e l l a rma t r i x ， E C M) 的主要來 源 ，

5、 在肝纖維 化形 成過程 中起決定性 作用[ 1 - z ] 。激 活 的 HS C 大 量 產(chǎn) 生 并 分 泌 血 小 板 衍 生 生 長 因 子 ( p l a t e l e t — d e r i v e dg r o w t hf a c t o r ， P D G F ) 等 細 胞 因 子 ， 進一步激 活 自身及周 圍的靜 息HS C。 這些 細胞 因 子在 肝纖維 化 的形成 、 發(fā) 展和 逆轉(zhuǎn) 中發(fā)揮 著重要 作 用

6、[ z - 4 ] 。白介 素一 1 0 ( I L 一 1 0 ) 具有強大 的抑制 炎癥和 巨 噬細胞功 能的作用 。以往的研究表 明， 內(nèi)源性 I L 一 1 0可 減輕 肝臟 炎癥 ， 抑 制肝 纖維 化 的發(fā)展I s - s ] ； 研究 也 提示 ， 外源性 I L 一 1 0具有一 定 的抗纖維化作用 [ 4_ 1 3 ] ，但其具體機 制 尚不 明了。 筆者通過用P D G F和I L 一 1 0干預(yù)在體 外培養(yǎng)激 活的

7、 HS C細胞模型 ， 采用逆轉(zhuǎn)錄 一 聚合 酶鏈 反應(yīng) ( R T— P C R) 技 術(shù) ， 比較分析 各組 HS C凋亡 相關(guān)基 因b c 1 ． 2 ／ b a x的表達 情況 ， 探討 P D G F和 I L 一 1 0 在 HS C增殖 與凋亡 中的作用 。1 材料與方 法 1 ． 1材料 Wi s t a r 大 鼠購 自上海 實驗 動 物 中心 。總R NA抽提 試劑盒 ( 深 圳品美生物工程公 司) ， 逆轉(zhuǎn) 錄 酶

8、 ( P r o me g a 公 司 ) ， P C R試 劑 ( 上 海生 工 生物 工 程技 術(shù)服 務(wù)有 限公司 ) ， D ME M ( Gi b c o公司 ) 。P C R引物 由上海生工 生物 工程 技術(shù)服務(wù)有 限公 司合成 。1 ． 2 方法 1 ． 2 ． 1HS C的分離 、 培養(yǎng)和鑒 定 Wi s t a r 大 鼠， 雄 性 ， 體質(zhì)量 4 5 0 - - ~ 5 0 0g ， 參照文獻 [ - 1 4 3 方法

9、原 位灌流 收稿日期t2 0 0 3 — 1 2 — 1 2修回日期 ： 2 0 0 4 — 0 1 — 0 7基金項 且t 福建省科技廳科技開發(fā)計劃項目( 2 0 0 3 D 0 5 )作者單位t 福建醫(yī)科大學(xué) 附屬協(xié)和醫(yī)院消化內(nèi)科， 福州 3 5 0 0 0 1作者簡介 t 張生君 ( 1 9 7 8 ~) ， 女， 福建醫(yī)科大學(xué)2 0 0 2 級碩士研究生 通訊作者 王小眾 分離H S C， 培 養(yǎng)于含1 0胎牛血清 的D ME

10、M 培 養(yǎng)液 中 ， D e s mi n染色免 疫細 胞化 學(xué)方法 鑒 定 ， 陽性 細 胞 占9 5左右 。 原代 培養(yǎng)4d后傳代培 養(yǎng) ， 用a — S MA 免 疫細胞 化學(xué)染色 ， 9 8 ％的細胞呈 a — S MA 陽性 。1 ． 2 ． 2H S C干 預(yù)分 組 將 傳 代培 養(yǎng) 的 HS C用 含 1 0 ％胎 牛 血 清 的 D ME M 培 養(yǎng) 液 稀 釋 成 5× 1 0 ‘mL _ 。 ， 接 種 于

11、 2 4孔 培 養(yǎng)板 ， 待 細胞 鋪 滿孔 底 ， 換 含 1胎牛血清的D ME M， 培養(yǎng)2 4h ， 吸棄 上清液 ， 而后 分 為 4 組 ： 對 照組 ( C組 ) ， P D G F干預(yù)組 ( P組 ) ， I L 一1 0干 預(yù) 組 ( I組 ) ， I L 一 1 0 +P D G F共 同 干 預(yù) 組 ( T組) 。 對 照組加含 1 ％胎牛血清 的D ME M 1mL， 各干 預(yù)組分別再 加入P D G F2 0n

12、 g ， I L 一 1 02 0n g和 P D G F2 0n g +I L 一 1 02 0n g ， 每組 5 孔 ， 培養(yǎng) 2 4h 。1 ． 2 ． 3R N A 抽提 用 R NA 抽提試 劑盒抽 提各 孔 HS C 的總 R NA， 分 光光 度法 測 R NA 含 量及 純 度 ，D2 6 0 ／ D2 8 01 ． 8 ～ 2 ． 0 。1 ． 2 ． 4b c l 一 2 ／ b a xmR N A 檢 測 采 用

13、 R T — P C R 技 術(shù) ， 設(shè) 置 f } _ a c t i n為 內(nèi)對 照 ， 引 物 序列 ： f } _ a c t i n ： 上 游 5 ’ 一 C C A AC C GT G A AA AG AT GA C C 一 3 ’ ， 下 游 5 ’ ．C A G G AG G AG C A AT G A TC T T G 一 3 ’ ( 擴 增產(chǎn) 物 6 6 0b p) ； b c l 一 2 ： 上 游 5 ’ 一

14、T AT G AT AAC C G G G AG ATC G T G A T C 一 3 ’ ，下 游 5 ’ 一 G T G C A G AT G C C G G TT C A G G T AC T C 一 3 ’ ( 擴增產(chǎn)物 5 2 5b p ) ； b a x ： 上游 5 ’ 一G AC AC C T G AG C T G AC C T T G G一 3 ’ ， 下游 5 ’ 一 G AGG AA G T C C A G T

15、G T C C A G C 一 3 ’ ( 擴增 產(chǎn)物 3 1 0b p ) 。P C R反應(yīng) 參數(shù) ： 9 4℃預(yù)變 性 5mi n ， 9 4℃變 性 4 5S ， 6 0℃退火 3 0S ， 7 2℃延伸1mi n ， 3 0循環(huán) ； 7 2℃ 延伸 7m i n 。1 ． 2 ． 5 結(jié)果判定 將R T — P C R產(chǎn)物在2瓊脂糖 凝 膠 上進行 電泳 ， 用 凝膠成像 系統(tǒng)測 量擴增 條帶 輝 度 維普資訊 http://w

16、ww.cqvip.com 2 7 0福 建 醫(yī)科大 學(xué)學(xué) 報 2 0 0 4 年 4 月 第 3 8 卷第 2期 表 達 ， 說 明 I L 一 1 O 不僅能抑制 H S C的增殖 ， 通過 促進 HS C 表 達 F a s L 而 促 進 其 凋 亡 L 1 。； 還 可 通 過 增 加 b a x ／ b c l 一 2比值 而促進 其凋亡 。雖然 S a i l e 等研 究發(fā) 現(xiàn)阻斷 F a s ／ F a s L系統(tǒng)可 完

17、全 阻斷 HS C的 自發(fā)性 凋 亡 ， 提 示這 一 系統(tǒng) 是 H S C凋 亡 的關(guān) 鍵通 路L 2； 但 筆 者研究結(jié)果提 示 b c l 一 2 ／ b a x 通 路也是 H S C凋亡的重 要途徑之 一[ 2 ‘ _ 2 5 ] 。本研 究結(jié)果 進一步顯 示 I L 一 1 O 具 有促進 H S C凋 亡的作用 ， 表 明這是 I L 一 1 O抗肝纖 維 化 的又一重要 途徑 。體 內(nèi)及體 外研究均表 明活化 的 H S

18、 C能表達 I L 一1 O ， 還 表 達 I L 一 1 O受 體[ 2 3 , 2 6； 而 P D G F進 一 步 激 活 H S C時 ， 對 b c l 一 2和 b a x表達 的影響與 I L 一 1 O 的作用 相 似 。因此 有 理 由推 測 P D G F有 可 能是通 過增 加 H S C 中I L 一 1 O的表達 而對b c l 一 2 和b a x的表達起調(diào)節(jié) 作用 。 由于P D G F與I L 一 1

19、 O 共 干預(yù)時并沒有表現(xiàn) 出很 好 的協(xié) 同作 用 ， 故不 排除二 者經(jīng) 由不 同的途徑 起作 用 的可 能 ， 具體機 制有待深入研 究。參考文獻 ：[ 1 ] G r e s s n e rA M ． T r a n s d i f f e r e n f i a f i o no fh e p a t i cs t e l l a t ec e l l s ( I t oc e l l s ) t om y o f i b o

20、 b l a s t s ： ak e ye v e n ti nh e p a t i cf i b r o g e n e s i s [ J ] ．Ki d e n yI n t ，1 9 9 6 ， 4 9 ( S u p p 1 ) ： 3 9 — 4 5 ．[ 2 3R o c k e yD C ．T h ec e l la n dmo l e c u l a rb i o l o g yo fh e p a t i cf

21、i b r o g e —n e s i s ．C l i n i c a la n dt h e r a p e u t i ci m p l i c a t i o n s [ J ] ．C l i nL i v e rDi s 。2 0 0 0 。 4 ( 2 ) ： 3 1 9 — 3 5 5 ．[ 3 ] F r i e d m a nS L ． C y t o k i n sa n df i b r o g e n e s

22、i s [ J ] ．S e miL i v e rD i s ，1 9 9 9 ， 1 9 ( 2 ) l 1 2 9 — 1 4 0 ．[ 4 3Z h a n gL J 。 YuJ P ， L iD， e ta 1 ．E f f e c t so fc y t o k i n e so nc a r b o nt e t r a c h l o r i d e — i n d u c e dh e p a t i cf i b r

23、 o g e n e s i si nr a t s [ J ] ．Wo r l dJG a s t r o e n t e r o l 。2 0 0 4 ， 1 0 ( 1 ) t 7 7 — 8 1 ．[ 5 3T h o mp s o nK， Ma l t b yJ ， F a l l o w f i e l dJ ， e ta 1 ．I n t e r n e u k i n 一 1 0e x p r e s s i o na

24、n df u n c t i o ni nex p e r i m e n t a lmur i n el i v e ri nf l a m ma —t i o na n df i b r o s i s [ J ] ．He p a t o l o g y 。 1 9 9 8 。 2 8 ( 6 ) ： 1 5 9 7 — 1 6 0 6 ．[ 6 3L o u i sH。 L a e t h e mJ L。 WuW ， e ta 1

25、 ．I n t e r l e u k i n 一 1 0c o n t r o l sn e u t r o p hi l i ci n f i l t r a t i o n， h e p a t o c y t epr o l i f e r a t i o n， a n dl i v e rf i —b r o s i si n d u c e db yc a r b o nt e t r a c h l o r i d ei

26、nm i c e [ J ] ．He p a t o l o -g y，1 9 9 8 ， 2 8 ( 6 ) t 1 6 0 7 - 1 6 1 5 ．[ 7 1 張莉娟 ， 王小眾 ， 黃 月紅， 等．白介素一 1 O 對實驗性肝纖維化的 影 響 [ J ] ．中華 消化 雜 志 ， 2 0 0 2 ， 2 2 ( 3 ) ： 1 7 9 — 1 8 0 ．[ 8 3 陳治新， 張莉娟 ， 陳運新 ， 等．胰島素樣生長因子一 1 受

27、體在實驗 性肝纖維化 中的表達及 I L 一 1 O 干預(yù)的作用[ J ] ．福建醫(yī)科大學(xué) 學(xué) 報 ， 2 0 0 2 ， 3 6 ( 2 ) ， 1 3 4 — 1 3 6 ．[ 9 3 黃月紅， 張莉娟， 李 丹， 等． I L 一 1 O對實驗性肝纖維化大 鼠基 質(zhì)金屬蛋 白酶一 2 影響的研究[ J ] ．肝臟，2 0 0 1 ， 6 ( 3 ) 。 1 6 2 — 1 6 4 ．[ 1 O ] 黃月紅 ， 張莉娟， 陳運新 ，

28、 等．白介素． 1 O 對實驗性肝纖維化大 鼠大 鼠基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑一 1 ， 一 2的影響[ J ] ．福建醫(yī)科大 學(xué)學(xué)報 ， 2 0 0 3 ， 3 7 ( 3 ) ： 2 4 4 — 2 4 6 ．[ 1 1 ] Wa n gX Z ， Z h a n gL J ， L iD， e ta 1 ．E f f e c to ft r a n s mi t t e ra n di n —t e r l e u k i n 一 1 0

29、o nr a th e p a t i cf i b r o s i si n d u c e db yC C 1 4 [ J ] ．W o r l dJGa s t r ot e r o l ，2 0 0 3 。 9 ( 3 ) t 5 3 9 — 5 4 3 ．[ 12 ] Wa n gX Z ， C h e nZ X， Z h a n gL J ， e ta 1 ．E x p r e s s i o no fi n s u l i

30、 n —l i k eg r o wt hf a c t o r1a n di n s u l i n — l i k eg r o wt hf a c t o r1r e c e p t o ra n di t si n t e r v e n t i o nb yi n t e r l e u k i n 一 1 0i ne x p e r i me n t a lh e p a t i cf i b r o s i s [ J ]

31、 ．Wo r l dJG a s t r o t e r ol ， 2 0 0 3 ， 9 ( 6 ) l 1 2 8 7 — 1 2 9 1 ．[ 1 3 ] 陳運新， 王小眾 ， 翁山耕， 等．白細胞介素一 1 O 對肝星形細胞增 殖及表達F a s ／ F a s 配體的影響[ J ] ．中華肝臟病雜志， 2 0 0 3 ，1 1 ( 1 O ) ： 6 3 7 · 6 4 0 ．[ 1 4 ] 翁山耕， 冷希賢， 魏玉

32、華， 等． 改 良法大 鼠肝星形細胞 的分離 培養(yǎng)及鑒定[ J ] ．北京大 學(xué)學(xué)報( 醫(yī)學(xué)版) ，2 0 0 1 ， 3 3 ( 1 ) 。 8 3 —86 ．[ 1 5 3B a t a l l e rR。 B r e n n e rD A ．H e p a t i cs t e l l a t ec e l l sa sat a r g e tf o rt h et r e a t m e n to fl i v e rf i b

33、 r o s i s [ J ] ． S e m i nL i v e rD is ，2 0 0 1 ， 2 1( 3 ) l 4 3 7 — 4 5 1 ．[ 1 6 ] Al b a n i sE， F r i e d m a nS L ．H e p a t i cf i b r o s i s ．P a t h o g e n e s i sa n dp r i n c i p l e so ft h e r a p y [ J

34、] ．C l i nL i v e rD is ，2 0 0 1 ， 5 ( 2 ) l3 1 5 —33 4 ．[ 1 7 ] L iD， F r i e d m a nS L ．L i v e rf i b r o g e n e s i sa n dt h er o l eo fh e p a t i cs t e l l a t ec e l l s ： n e wi n s i g h t sa n dp r o s p e

35、c t sf o rt h e r a p y [ J ] ．JGa s t r oe n t e ro lH e p a t o l ，1 9 9 9 ， 1 4 ( 7 ) l 6 1 8 — 6 3 3 ．[ 1 8 3Ma r r aF ， C h o u d h u r yG G， P i n z a n iM ， e t． R e g u l a t i o no fp l a t e l e t — d e r i v e

36、 dg r o wt hf a c t o rs e c r e t i o na n dg e n ee x p r e s s i o ni nh u ma nl i v e rf a t — s t o r i n gc e l l s [ J ] ．G a s t r o e n t e r o l o g y ， 1 9 9 4 ，1 0 7 ( 4 ) l 1 1 1 0 — 1 1 1 7 ．[ 1 9 ] K i n n

37、 ma nN， Go r i aQ， We n d u mD， e ta 1 ．H e p a t i cs t e l l a t ec e l lpr o l i f e r a t i o n i sa ne a r l yp l a t e l et · - de r i v e dgr o w t hf a c t or · - m e d i - -a t e dc e l l u l a re v e

38、 n ti nr a tc h o l e s t a t i cl i v e ri n j u r y [ J ] ． L a bI n v e s t ，2 0 0 1 ， 8 1 ( 1 2 ) l1 7 0 9 — 1 7 1 6 ．[ 2 o 3S a i l eB ， K n i t t e lT， Ma t t h e sN， e ta 1 ．C Dg s ／ C D g s L — m e d i a t e da p

39、 o p t o s i so ft h eh e p a t i cs t e l l a t ec e l 1 ．A me c h a n i s m t e r mi n a t —i n gu n c o n t r o l l e dh e p a t i cs t e l l a t ec e l lp r o l i f e r a t i o nd u r i n gh e p —a t i ct i s s u e

40、r e p a i r [ J ] ． A mJP a t h o l ，1 9 9 7 ， 1 5 1 ( 5 ) ： 1 2 6 5 —1 2 7 2 ．[ 2 1 ] We n gS ， L e n gX， We iY ．I n t e r l e u k i n - 1 0i n h i b i t st h ea c t i v a —t i o no fc u l t u r e dr a th e p a t i cs t

41、 e l l a t ec e l l si n d u c e db yKu p f f e rc e l l s [ J ] ．Na t lMe dJC h i n a ， 2 0 0 2 ， 8 2 ( 2 ) I 1 0 4 — 1 0 7 ．[ 2 2 ] Y o s h i d o meH， Ka t oA， F Aw a r d sMJ ， 甜a 1 ．I n t e r l e u k i n 一 1 0s u —p r

42、 e s s e sh e p a t i ci s c h e mi a ／ r e p e r f u s i o ni n j u r yi nm i c eli mp l i c a —t i o n so fac e n t r a lr o l ef o rn u c l e a rf a c t o rk a p p aB [ J ] ． He p a t o l —o g y ·1 9 9 9 · 3

43、 0 ( 1 ) l2 0 3 — 2 0 8 ．[ 2 3 ] Wa n gS C， O h a t aM ， S e h r u mL ， e ta 1 ．E x p r e s s i o no fi n t e r —l e u k i n 一 1 0b yi nv i t r o a n di nv i v oa c t i v a t e dh e p a t i cs t e l l a t ec e l l s [ J

44、 ] ．JB i o lC h e m，1 9 9 8 ， 2 7 3 ( 1 ) l 3 0 2 — 3 0 8 ．[ 2 4 ] I s s aR ， W i l l i a m sE ， T r i mN， e ta 1 ．A p o p t o s i so fh e p a t i cs t e 1 ．1 a t ec e l l et i n v ol v e me n ti nr e s o l u t i o n o

45、fb i l i a r yf i b r os i sa n dr e g —u l a t i o nb ys o l u b l eg r o w t hf a c t o r s [ J ] ． G u t ， 2 0 0 1 ， 4 8 ( 4 ) ： 5 4 8 —55 7 ．[ 2 5 3S a i l eB ， Ma t t h e sN， E 1A r m o u c h eH。 e ta 1 ．T h eb c l

46、。 N Fk a p —p a Ba n dp 5 3 ／ p 2 1 w ~ ' as y s t e msa r ei n v o l v e di ns p o n t a n e o u sa p o p t o s i sa n di nt h ea n t i - a p o p t o t l ce f f e c to fTGF — b e t ao rT N F — a l p h ao na c t i v

47、a t e dh e p a t i cs t e l l a t ec e l l s [ J ] ．E u rJC e l lBi o l ，2 0 0 1 ， 8 0 ( 8 ) l 5 5 4 — 5 6 1 ．[ 2 6 ] Ma t h u r i nP， X i o n gS ， K h a r b a n d aK K， e ta 1 ．I L 一 1 0r e c e p t o ra n dc o — r e c e

48、 p t o re x p r e s s i o ni nq u i e s c e n ta n da c t i v a t e dh e p a t i cs t e l l a t ec e i l s [ J ] ．A mJP h y s i o lG a s t r o i n t e s tL i v e r P h y s i o l ，2 0 0 2 。 2 8 2 ( 6 ) l G9 8 1 - 9 9 0 ．