基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)的肝細(xì)胞肝癌新型分子標(biāo)記物篩選、驗證及功能研究.pdf

1、背景：
　　肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是一種來源于肝實質(zhì)細(xì)胞的肝臟原發(fā)性惡性腫瘤。HCC是全球第五大惡性腫瘤，每年的致死人數(shù)在所有惡性腫瘤中排名第二。我國是HCC高發(fā)國家，每年HCC的發(fā)病人數(shù)和致死人數(shù)都占全球半數(shù)以上。在我國60歲以下的男性惡性腫瘤患者中，HCC發(fā)病率和致死率高居第一位。近年來，隨著影像學(xué)、外科學(xué)等技術(shù)的不斷發(fā)展，HCC的診治已經(jīng)取得了長足的進(jìn)步，但是仍然存在有效診斷標(biāo)

2、記物缺乏、術(shù)后復(fù)發(fā)率高和術(shù)后生存率低等問題。甲胎蛋白(Alpha-Fetoprotein，AFP)是一個傳統(tǒng)的HCC分子標(biāo)記物，其作為HCC血清學(xué)診斷標(biāo)記物的陽性率只有60％-70％，許多HCC患者確診時，往往已經(jīng)處于病程進(jìn)展的中晚期，失去了治療機(jī)會。目前HCC的治療也傾向于多元化，除外傳統(tǒng)的手術(shù)切除，放化療、藥物靶向治療等越來越普及，但是化療及藥物靶向治療的效果往往不佳，原因之一就是許多患者對各種抗腫瘤藥物具有耐藥性。針對這一現(xiàn)象，我

3、們發(fā)現(xiàn)泛素特異性蛋白酶22(Ubiquitin-specific protease22，USP22)是肝癌多藥耐藥的分子標(biāo)記物并揭示了相關(guān)作用機(jī)制，為肝癌病人藥物靶向治療的個性化選擇提供了新思路。目前，轉(zhuǎn)錄組學(xué)(transcriptomics)、基因組學(xué)(genomics)和蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)等組學(xué)研究方興未艾。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)情況的一門學(xué)科。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，越來越多的腫瘤關(guān)鍵分子標(biāo)記物有望被發(fā)現(xiàn)。

4、這些關(guān)鍵分子標(biāo)記物在腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制、腫瘤篩查與早診、預(yù)后預(yù)警和治療靶點篩選及療效評判等方面發(fā)揮重要作用。
　　目的：
　　本研究基于HCC臨床樣本，通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，篩選出與HCC診斷、惡性生物學(xué)特征和預(yù)后預(yù)警等相關(guān)的潛在分子標(biāo)記物;通過在HCC細(xì)胞中上調(diào)或者下調(diào)這些分子標(biāo)記物的表達(dá)，對它們進(jìn)行功能研究，明確這些分子標(biāo)記物的在HCC中的作用及相關(guān)機(jī)制;最終，根據(jù)臨床驗證和細(xì)胞學(xué)實驗結(jié)果，明確它們是HCC的分子標(biāo)記物，為

5、HCC的診斷、預(yù)后預(yù)警和治療靶點篩選等提供新思路。
　　方法：
　　一、運(yùn)用包含39303個長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）序列和32205個mRNA序列的Agilent表達(dá)譜芯片，檢測并分析比較5對HCC組織及對應(yīng)癌旁組織的表達(dá)譜差異，根據(jù)P值大小和差異倍數(shù)，并結(jié)合文獻(xiàn)閱讀，發(fā)現(xiàn)可以作為HCC潛在分子標(biāo)記物的差異基因（包括mRNA或lncRNA）。
　　二、收集臨床樣本（包括組織

6、和血液），通過免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附劑測定(ELISA)和Western免疫印跡等實驗，研究差異基因表達(dá)情況并統(tǒng)計分析其與HCC患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后等的關(guān)系。明確這些差異基因是HCC的分子標(biāo)記物，可以作為潛在的HCC診斷標(biāo)記物、預(yù)后預(yù)警指標(biāo)或治療靶點。
　　三、應(yīng)用Bel-7402、Huh7等HCC細(xì)胞株，通過分別上調(diào)或者下調(diào)差異基因表達(dá)水平，開展Cell Counting Kit-8(CCK-8)實驗、細(xì)胞侵襲和遷移實驗、流式

7、細(xì)胞凋亡和周期實驗等細(xì)胞功能學(xué)實驗，檢測差異基因?qū)CC細(xì)胞各種腫瘤生物學(xué)行為的影響;運(yùn)用慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染差異基因的HCC細(xì)胞，通過裸鼠皮下成瘤實驗，研究差異基因?qū)CC細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響，明確這些差異基因?qū)CC的具體作用。
　　四、基于細(xì)胞功能學(xué)結(jié)果，進(jìn)一步運(yùn)用表達(dá)譜芯片技術(shù)，通過Western免疫印跡實驗，研究差異基因表達(dá)改變后HCC細(xì)胞中其它腫瘤關(guān)鍵蛋白或者通路的改變情況，明確這些差異基因?qū)CC的作用機(jī)制。

8、　　結(jié)果：
　　一、人微纖絲關(guān)聯(lián)蛋白4(microfilament-associated protein4，MFAP4)是HCC診斷和預(yù)后預(yù)警的分子標(biāo)記物，在HCC中發(fā)揮抑癌作用
　　1.表達(dá)譜芯片顯示，mRNA MFAP4在HCC組織中顯著低表達(dá)(P＜0.05)。
　　2.熒光定量PCR結(jié)果顯示MFAP4的mRNA水平在HCC組織中表達(dá)水平明顯低于對應(yīng)癌旁組織(P＜0.05)。
　　3.Western免疫印跡結(jié)

9、果顯示MFAP4蛋白在HCC癌組織中表達(dá)水平明顯低于對應(yīng)癌旁組織(P＜0.05)。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附劑測定顯示，和正常人相比，肝硬化和單純肝癌病人血清中MFAP4表達(dá)都有顯著降低(P＜0.05)，通過檢測血清中MFAP4的濃度可有效鑒別診斷HCC患者與正常人、HCC患者與單純肝硬化患者、HCC患者與單純肝硬化患者;臨床病理參數(shù)分析結(jié)果顯示肝癌病人血清中MFAP4表達(dá)與性別有相關(guān)性(P=0.000)，男性HCC患者血清MFAP4

10、濃度明顯高于女性HCC患者。
　　5.免疫組化結(jié)果顯示，MFAP4在HCC組織中表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。在HCC的發(fā)生發(fā)展過程中，MFAP4表達(dá)量逐漸降低(P＜0.05)。HCC組織中，MFAP4表達(dá)普遍降低;HCC癌旁組織中，MFAP4表達(dá)量越低，患者預(yù)后越差(P=0.027)。
　　6.在肝癌Bel-7402細(xì)胞中上調(diào)MFAP4表達(dá)后，細(xì)胞增殖、侵襲和遷徙能力降低;細(xì)胞凋亡增加且有S期阻滯現(xiàn)象;細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力也降

11、低。
　　7.在肝癌Bei-7402細(xì)胞中上調(diào)MFAP4表達(dá)后，一些腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)量會發(fā)生改變。p27、pRB、BCL-Xs、CDK4和CDK6蛋白表達(dá)量升高。
　　二、長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)RP11是HCC的新型預(yù)后預(yù)警分子標(biāo)記物和潛在治療靶點，在HCC中發(fā)揮促癌作用
　　1.表達(dá)譜芯片顯示，lncRNA RP11在HCC組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05）。

12、　　2.熒光定量PCR結(jié)果顯示RP11在HCC組織中表達(dá)水平明顯高于對應(yīng)癌旁組織（P＜0.05）。
　　3.HCC組織中RP11的表達(dá)水平與腫瘤大小和組織學(xué)分化有明顯相關(guān)性(P=0.017和P=0.020)。腫瘤越大、組織學(xué)分化越差，HCC組織中RP11表達(dá)量越高;HCC組織中RP11表達(dá)量越高，患者總體生存率也越低(P=0.019)
　　4.下調(diào)RP11表達(dá)后，HCC細(xì)胞增殖、侵襲和遷徙能力顯著減弱，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞周期

13、改變;上調(diào)RP11表達(dá)后，HCC細(xì)胞增值和體內(nèi)成瘤能力顯著增強(qiáng)。
　　5.下調(diào)RP11后，HCC細(xì)胞CyclinE表達(dá)降低，活化Caspase-3和活化PARP表達(dá)升高。通過表達(dá)譜芯片篩選與進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)下調(diào)RP11的表達(dá)可以激活HCC細(xì)胞的TGF-β/SMAD信號通路。
　　結(jié)論：
　　一、MFAP4在HCC患者血清及HCC組織中都顯著低表達(dá)。MFAP4在血清中的表達(dá)差異可有效鑒別診斷HCC患者與正常人、HCC患者

14、與單純肝硬化患者、HCC患者與單純肝硬化患者;MFAP4在HCC癌旁組織中的表達(dá)水平越低，患者預(yù)后越差。MFAP4是HCC診斷和預(yù)后預(yù)警的新型分子標(biāo)記物
　　二、MFAP4是HCC的抑癌基因，上調(diào)MFAP4的表達(dá)可有效抑制HCC細(xì)胞的腫瘤生物學(xué)行為和體內(nèi)成瘤能力;通過影響p27等腫瘤關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，MFAP4發(fā)揮抑癌作用;
　　三、RP11在HCC組織表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)癌旁組織，RP11在癌組織的表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差

15、。RP11在HCC組織中的表達(dá)量還與腫瘤大小和分化程度有明顯相關(guān)性。RP11是HCC的潛在預(yù)后預(yù)警分子標(biāo)記物;
　　四、RP11是HCC的促癌基因，在HCC細(xì)胞中下調(diào)RP11的表達(dá)水平可顯著抑制HCC細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為，在HCC細(xì)胞中上調(diào)RP11的表達(dá)水平可顯著促進(jìn)HCC細(xì)胞腫瘤生物學(xué)行為和體內(nèi)成瘤能力，是HCC的潛在治療靶點;RP11可以影響CyclinE、Caspase-3等腫瘤關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，下調(diào)的RP11可以激活TGF-β