prtP編碼的細(xì)胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin對(duì)干酪乳桿菌粘附及免疫作用的影響.pdf

1、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)屬于乳桿菌屬(Lactobacillus)，是可用于保健食品的益生菌，能夠耐受人體的防御機(jī)制，其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小腸的膽汁酸等。干酪乳桿菌具有促進(jìn)細(xì)胞分裂，產(chǎn)生抗體免疫及預(yù)防癌癥等生理功能。由于干酪乳桿菌對(duì)其宿主營(yíng)養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效，現(xiàn)成為人們研究、開發(fā)、生產(chǎn)的焦點(diǎn)。
　　最新研究發(fā)現(xiàn)，在乳酸乳球菌中，細(xì)胞外膜的絲氨酸蛋白酶lactocepin能

2、介導(dǎo)乳酸菌的黏附作用，而且在某些乳酸菌中，lactocepin對(duì)腸道炎性具有良好的抑制作用。它能夠降解部分炎性細(xì)胞因子。因此對(duì)這種細(xì)胞表面蛋白的深入研究不但可以提高益生菌的益生功能，且可為開發(fā)腸道免疫調(diào)節(jié)制劑提供理論基礎(chǔ)。
　　1干酪乳桿菌21858 prtP基因突變株構(gòu)建及其生物學(xué)特征。
　　根據(jù)GenBank信息，細(xì)胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin由prtP基因編碼，本文通過通過λ-Red重組技術(shù)，替換干酪乳桿菌p

3、rtP基因，構(gòu)建干酪乳桿菌(21858)prtP基因突變株(21858△)。
　　通過測(cè)定兩株乳酸菌的基本生物學(xué)特性發(fā)現(xiàn)21858△和21858生長(zhǎng)曲線類似，21858△自凝聚率在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都低于21858，且時(shí)間越長(zhǎng)差距越明顯。21858與四種致病菌的共凝聚率大于21858△。21858△的疏水率為為44.1±1.5％，大于21858疏水率23.9±0.62％，且具有顯著差異(P＜0.05)。對(duì)致病菌的抑制效果21858好于21

4、858△，但都沒明顯差異(P＞0.05)。提示prtP基因?qū)Ω衫胰闂U菌生長(zhǎng)曲線無影響，敲除prtP基因會(huì)降低干酪乳桿菌的自凝聚率和與治病菌的共凝聚率，會(huì)提升疏水率，對(duì)致病菌抑制性有降低趨勢(shì)。
　　221858prtP基因突變株21858△粘附能力研究
　　通過建立體內(nèi)外粘附模型測(cè)定21858和21858△對(duì)腸粘液、細(xì)胞及小鼠腸道的粘附能力。結(jié)果顯示21858小腸粘液粘附率4.638±2.3％，21858△小腸粘液粘附率3.6

5、65±4.5％，具有顯著差異(P＜0.05)。通過細(xì)胞粘附模型發(fā)現(xiàn)21858對(duì)三種細(xì)胞的粘附性都大于21858△。21858和21858△對(duì)脾臟細(xì)胞的粘附?jīng)]有顯著差異(P＞0.05)，對(duì)小腸上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的粘附性有顯著差異(P＜0.05）。采用流式細(xì)胞技術(shù)分析乳酸菌在體內(nèi)粘附情況，發(fā)現(xiàn)在小鼠的十二指腸、空腸、回腸中21858的粘附率高于21858△，但是在結(jié)腸中21858△粘附率要高于21858，且在灌胃后21858在腸道各個(gè)部位粘

6、附菌數(shù)都隨時(shí)間存在一定上升趨勢(shì)。但兩株菌在空腸內(nèi)隨著時(shí)間有明顯下降趨勢(shì)。且發(fā)現(xiàn)回腸中總粘附菌數(shù)高于小腸其他部位。提示prtP基因編碼的細(xì)胞外膜絲氨酸蛋白酶lactocepin，能夠提高干酪乳桿菌對(duì)小腸粘液、細(xì)胞表面以及小鼠腸道的粘附。
　　3.21858 prtP基因突變株21858△免疫效力研究
　　研究發(fā)現(xiàn)21858能提升小鼠體重，且與對(duì)照組有顯著差異(P＜0.05)，21858對(duì)體重的提升效果好于21858△，時(shí)間越長(zhǎng)

7、效果越明顯。21858和21858△對(duì)免疫器官的指數(shù)有特異性影響。21858和21858△對(duì)胸腺指數(shù)在短期內(nèi)(10d)沒有顯著影響(P＞0.05)，但在較長(zhǎng)期(20 d)，21858和21858△高劑量組相對(duì)于對(duì)照組都有顯著差異(P＜0.05)，而其他各組相對(duì)于對(duì)照組無顯著差異。且高劑量組胸腺指數(shù)相對(duì)中劑量組有顯著差異，提示干酪乳桿菌對(duì)胸腺指數(shù)影響存在劑量依賴關(guān)系。對(duì)于脾臟指數(shù)，兩種干酪乳桿菌在整個(gè)喂養(yǎng)階段都有提高的作用，且提升效果具有

8、濃度依賴性，濃度越高，提升越明顯。21858提升效果優(yōu)于21858△。說明21858對(duì)免疫器官的影響要優(yōu)于21858△。
　　對(duì)免疫細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)21858和21858△在飼喂的整個(gè)階段均能提高小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，且在相同時(shí)間和劑量下21858組的轉(zhuǎn)化率高于21858△組。對(duì)巨噬細(xì)胞的活化研究提示21858能通過提高巨噬細(xì)胞的能量代謝水平或吞噬能力來活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其對(duì)抗原的處理能力。但21858△對(duì)巨噬細(xì)胞的活化沒有明顯提升作