基于酶循環(huán)放大技術(shù)的生物傳感分析研究及其在腫瘤標(biāo)志物檢測中的應(yīng)用.pdf

1、本文采用表面等離子共振及表面增強(qiáng)拉曼光譜分析檢測方法，基于核酸適體與靶分子的高親和力和特異性識別作用，結(jié)合納米顆粒生物條碼技術(shù)及DNA聚合酶、核酸內(nèi)切酶等工具酶的自身特性，構(gòu)建了基于雙適體識別滾環(huán)復(fù)制放大的放大方法、納米顆粒增強(qiáng)-鏈替換循環(huán)放大方法、靶向激活雙重循環(huán)放大方法及級聯(lián)循環(huán)放大方法，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)、基因及腫瘤細(xì)胞等腫瘤標(biāo)志物的高靈敏及高選擇性檢測。主要研究內(nèi)容如下:
　　1、提出了新型的表面等離子共振適體傳感器并將其用于蛋

2、白質(zhì)的高靈敏檢測。首次將滾環(huán)復(fù)制放大與表面等離子共振技術(shù)相結(jié)合，以納米金生物條碼探針作為信號標(biāo)記，通過滾環(huán)復(fù)制反應(yīng)，將信號探針與帶有大量重復(fù)序列的滾環(huán)復(fù)制的長鏈相結(jié)合，使檢測信號顯著增強(qiáng)，以凝血酶為靶蛋白質(zhì)，檢測限可達(dá)0.78aM。采用發(fā)夾結(jié)構(gòu)的適體捕獲探針及雙適體識別體系，提高了檢測的選擇性，并采用加標(biāo)回收法將該方法用于實際血清樣品的檢測，進(jìn)一步驗證了檢測體系的實用性。該方法操作簡單，線性范圍寬，靈敏度高，選擇性好，適用于復(fù)雜生物樣品

3、中蛋白質(zhì)的選擇性分析，為生物學(xué)研究、基因檢測以及臨床診斷提供了有效的分析手段。
　　2、構(gòu)建了一種基于納米顆粒增強(qiáng)及多級信號放大的SPR檢測DNA及腫瘤細(xì)胞的新方法。通過靶DNA引發(fā)鏈置換循環(huán)放大和滾環(huán)復(fù)制放大形成雙重信號放大反應(yīng)，并結(jié)合磁珠作為DNA載體的性質(zhì)，以磁珠作為信號放大的“中轉(zhuǎn)站”，磁珠生物條碼探針不僅作為反應(yīng)單元，發(fā)生鏈置換循環(huán)放大反應(yīng)，還作為信號放大的載體，增大了滾環(huán)復(fù)制產(chǎn)物的負(fù)載量，形成多級信號放大體系，以金納米

4、粒子作為信號探針，采用表面等離子共振技術(shù)實現(xiàn)了靶DNA的高靈敏檢測，檢測限可達(dá)1fM。并迸一步基于細(xì)胞適體對細(xì)胞表面蛋白的特異性識別及高親和力，考察了該反應(yīng)體系對腫瘤細(xì)胞檢測的適用性，通過細(xì)胞適體負(fù)載的磁珠進(jìn)行磁性分離，降低了體系的背景噪音，對淋巴瘤Ramos細(xì)胞的檢測限可達(dá)76個細(xì)胞，實現(xiàn)了腫瘤細(xì)胞的高靈敏檢測并具有良好的選擇性，適用于復(fù)雜生物樣品的檢測。
　　3、基于適體與靶分子的結(jié)構(gòu)互變性質(zhì)，構(gòu)建了靶向激活雙重循環(huán)放大的SP

5、R檢測系統(tǒng)用于溶菌酶的檢測。將靶分子與適體的特異性識別作用轉(zhuǎn)化成雙重循環(huán)放大反應(yīng)的切入點(diǎn)，從而引發(fā)靶分子的聚合替換源頭放大和DNA鏈的聚合剪切放大反應(yīng)，提高了反應(yīng)的放大效率及選擇性，以溶菌酶作為目標(biāo)分析物，生物功能化的量子點(diǎn)探針為信號標(biāo)記，利用表面等離子共振檢測技術(shù)實現(xiàn)了溶菌酶的快速、靈敏檢測，檢測限可達(dá)76fM。并成功應(yīng)用于人血清實際樣品中溶菌酶的分析。該方法適用范圍廣、選擇性強(qiáng)、操作便捷，在蛋白質(zhì)分析及臨床診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景

6、。
　　4、構(gòu)建了新型的DNA級聯(lián)循環(huán)放大分子器件，并將其應(yīng)用于DNA和蛋白質(zhì)的SERS分析檢測中。以羅丹明染料分子標(biāo)記的納米金生物條碼作為信號探針，金芯片作為檢測基底，以溶菌酶作為目標(biāo)蛋白質(zhì)，通過溶菌酶與核酸適體的靶向識別，將與適體互補(bǔ)的靶DNA釋放出來從而引發(fā)上游的內(nèi)切酶循環(huán)放大，同時上游的產(chǎn)物又可以作為下游循環(huán)體系的DNA觸發(fā)器，引發(fā)鏈置換和發(fā)夾探針輔助的指數(shù)放大反應(yīng)，在檢測基底上捕獲大量的納米金拉曼信號探針，使拉曼信號顯著