苯醚甲環(huán)唑免疫檢測方法的研究.pdf

1、針對目前由于三唑類殺菌劑苯醚甲環(huán)唑的廣泛應(yīng)用所帶來的農(nóng)藥殘留問題，本文對苯醚甲環(huán)唑的免疫檢測方法進(jìn)行了研究，研究內(nèi)容主要包括:苯醚甲環(huán)唑半抗原的設(shè)計及合成，完全抗原的制備，多克隆抗體的制備及純化，免疫檢測方法的建立及其性能指標(biāo)的評價，以及高效液相色譜法的驗證實驗。
　　本研究以3，4'-二氯二苯醚為原料，在自制離子液體的催化作用下與溴代乙酰氯反應(yīng)合成中間體Ⅰ，然后中間體Ⅱ與4-氨基丁酸連接制備半抗原1(Hapten1)。采用中間體

2、Ⅰ與三唑鈉在異丁醇中反應(yīng)合成中間體Ⅱ，被硼氫化鈉還原后，在碘化鉀的催化作用下與氯乙酸乙酯反應(yīng)，水解后得到半抗原2(Hapten2)。將兩種半抗原分別與BSA、KLH偶聯(lián)制得4種免疫原，與HRP偶聯(lián)制得2種酶標(biāo)抗原，與OVA偶聯(lián)制得2種包被原。用4種免疫原共免疫8只雄性新西蘭大耳白兔，以制備多克隆抗體，其中以Hapten1-KLH免疫的NO.3兔子的抗血清效果最好，其效價為1∶64000，對1000μg/L苯醚甲環(huán)唑標(biāo)準(zhǔn)品的抑制率高達(dá)86

3、％，該抗體經(jīng)純化后濃度為2.12 mg/mL。
　　抗體以0.50μg/well包板，酶標(biāo)抗原Hapten1-HRP稀釋3000倍，以0.5％脫脂乳粉進(jìn)行封閉，樣品稀釋液為pH7.4的0.01 M PBS，建立了dc-ELISA檢測方法，其靈敏度IC50為67.96±2.73μg/L，檢測限IC15為8.86±0.34μg/L，與11種三唑類殺菌劑的交叉反應(yīng)率均小于0.01％。選取10種果蔬類樣品，經(jīng)正己烷提取，PBS稀釋后，進(jìn)行

4、加標(biāo)回收實驗，平均回收率為89.01％-103.43％，變異系數(shù)均小于14.33％，檢出限為443μg/kg。所建立的dc-ELISA檢測結(jié)果與HPLC檢測結(jié)果一致性良好，證明該方法準(zhǔn)確度較高。
　　包被原Hapten1-OVA以0.05μg/well包板，抗體稀釋2000倍，以0.5％脫脂乳粉進(jìn)行封閉，樣品稀釋液為pH7.4的0.01 M PBS，建立了ic-ELISA檢測方法，其靈敏度IC50為29.10±1.43μg/L，檢