雙孢蘑菇高氧氣調(diào)貯藏過程蛋白質(zhì)變化規(guī)律的研究.pdf

1、本研究以雙孢蘑菇為試驗(yàn)材料，主要圍繞其蛋白質(zhì)展開，分別從蛋白質(zhì)的提取方法、蛋白質(zhì)的 SDS-PAGE和雙向電泳、差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜分析鑒定等方面進(jìn)行。同時(shí)還對(duì)對(duì)照組和高氧氣調(diào)組的生理和品質(zhì)進(jìn)行分析，包括失重率、白度、硬度、細(xì)胞膜透性、PPO和POD酶活性等方面，進(jìn)一步通過雙向電泳與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，分析在不同處理組中的蛋白質(zhì)的表達(dá)，并對(duì)其差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行鑒定和功能分析。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面：
　　在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上運(yùn)用響應(yīng)曲面法

2、對(duì) Tris-HCl法提取蛋白質(zhì)的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最優(yōu)工藝為提取液濃度2.0mol/L，提取液 pH8.4，提取時(shí)間8h，提取率可達(dá)75.09％。將此參數(shù)運(yùn)用到 SDS-PAGE電泳中，改良 Tris-HCl提取方法，得到 SDS-PAGE圖，分析雙孢蘑菇蛋白質(zhì)亞基多分布在26.4~80.8 kD。
　　比較 TCA/丙酮法、尿素法、酚提法、改良 Tris-HCl法對(duì)雙孢蘑菇蛋白質(zhì)的提取結(jié)果，并進(jìn)行了 SDS-PAGE，分析

3、各種方法提取到的蛋白質(zhì)干粉的含量、蛋白純度以及條帶的清晰度、數(shù)量等，確定 TCA/丙酮法、改良 Tris-HCl法得到的蛋白干粉量最多，但是純度低，而酚提法、尿素法得到的蛋白質(zhì)干粉量少，但是純度高，而且在 SDS-PAGE中蛋白條帶數(shù)目多，蛋白條帶清晰。酚提法純度最高，效果最好。選用酚提法進(jìn)行雙向電泳。
　　將雙孢蘑菇分 CK組、80%O2+20%N2組、100%O2組，探究高氧氣調(diào)貯藏對(duì)其生理和品質(zhì)的影響。測(cè)定指標(biāo)有失重率、白度

4、、硬度、細(xì)胞膜透性、可溶性固形物含量、PPO的活性、POD的活性和呼吸速率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高氧氣調(diào)貯藏對(duì)減輕其組織褐變、延緩衰老、延長(zhǎng)貨架期具有一定的影響，且100%O2組效果要略優(yōu)于80%O2+20%N2組。在 SDS-PAGE圖中，三組的蛋白條帶數(shù)目、清晰度等差異不大。新鮮樣與褐變初期樣品無(wú)明顯差異，褐變末期蛋白條帶數(shù)目減少比較明顯。
　　對(duì) CK組和100%O2組的樣品進(jìn)行雙向電泳分離蛋白質(zhì)，通過串聯(lián)質(zhì)譜分析得到35個(gè)差異蛋白質(zhì)

5、點(diǎn)，對(duì)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到相應(yīng)的蛋白質(zhì)，成功了34個(gè)點(diǎn)，失敗了1個(gè)點(diǎn)，且這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)在對(duì)照組中呈上調(diào)表達(dá)。對(duì)倍數(shù)變化大于2的差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行列表分析，鑒定到蛋白質(zhì)名稱為酪氨酸酶、甲羥戊酸5-焦磷酸脫羧酶、硫-甲酰谷胱甘肽水解酶以及多數(shù)的未知蛋白。其中點(diǎn)6102覆蓋率達(dá)到51%，得分為734。鑒定得到的蛋白質(zhì)多為酶類活性物質(zhì)，它們與能量代謝、組織褐變等過程有關(guān)。高氧氣調(diào)貯藏有效的維持了雙孢蘑菇的商品價(jià)值，延緩其后熟衰老進(jìn)程，延