人參炔三醇對HepG2細胞中PXR-CYP3A4調(diào)控通路的影響及其機制研究.pdf

1、背景：
　　人參炔三醇（Panaxytriol,PXT）是高麗參、紅參提取物及參麥注射液中的重要活性成分之一，它能夠抑制許多腫瘤細胞的活性，有助于緩解某些癌癥療法的不良反應(yīng)，因而PXT在抗腫瘤方面有著較好的應(yīng)用前景。課題組前期研究表明，PXT能下調(diào)大鼠原代肝細胞中CYP3A1/2 mRNA的表達。那么在人源性的HepG2細胞中，PXT如何來調(diào)控CYP3A4的表達，值得深入探討。
　　目的：
　　研究PXT長短時干預(yù)對正

2、常HepG2細胞和高表達hPXR的HepG2細胞中PXR、CYP3A4 mRNA和蛋白表達的影響及對PXR-CYP3A4調(diào)控通路的影響機制，為進一步深入探索PXT與臨床藥物可能的相互作用提供實驗與理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建正常HepG2和高表達hPXR的HepG2細胞模型，描繪HepG2細胞的生長曲線；使用MTS法考察系列濃度的PXT對HepG2細胞的毒性作用。
　　2.使用Q-PCR、Western blo

3、t等技術(shù)手段，考察PXT長短時干預(yù)對正常HepG2細胞和高表達hPXR的HepG2細胞中PXR、CYP3A4 mRNA和蛋白表達的影響。
　　3.通過構(gòu)建質(zhì)粒、瞬時共轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報告基因法，考察PXT長短時干預(yù)對HepG2細胞中對PXR-CYP3A4調(diào)控通路的影響機制。
　　結(jié)果：
　　1.PXT對正常HepG2細胞中PXR和CYP3A4的影響
　　PXT短時間干預(yù)1h后，除5μM、10μM無明顯影響外（P＞

4、0.05），20μM、40μM、80μM的PXT對PXR和CYP3A4 mRNA表達均有顯著上調(diào)作用（P＜0.05）。PXR mRNA的表達分別上調(diào)49.53％，82.05%及115.25%；CYP3A4 mRNA的表達分別上調(diào)51.99%，94.25%及140.78%，且二者影響趨勢一致（R2=0.9875）。短時間干預(yù)1h，不同濃度的PXT對PXR和CYP3A4蛋白表達均無明顯影響（P＞0.05）。
　　PXT長時間干預(yù)24h

5、后，除5μM無明顯影響外（P＞0.05），10μM、20μM、40μM、80μM的PXT對PXR和CYP3A4 mRNA的表達均有顯著上調(diào)作用（P＜0.05）。PXR mRNA的表達分別上調(diào)33.37%，88.77%，137.90%及240.43%；CYP3A4 mRNA的表達分別上調(diào)49.88%，145.06%，246.15%及370.50%，且二者影響趨勢一致（R2=0.9904）。長時間干預(yù)24h，除5μM、10μM無明顯影響外（

6、P＞0.05），20μM、40μM、80μM的PXT對PXR及CYP3A4蛋白表達亦有顯著上調(diào)作用（ P＜0.05）。PXR蛋白的表達分別上調(diào)51.96%，151.72%及220.21%；CYP3A4蛋白的表達分別上調(diào)98.51%，167.34%及261.57%，且二者影響趨勢一致（R2=0.9755）。
　　2.PXT對高表達hPXR的HepG2細胞中PXR和CYP3A4的影響
　　PXT短時間干預(yù)1h后，除5μM無明顯影

7、響外（P＞0.05），10μM、20μM、40μM、80μM的PXT對高表達hPXR的HepG2細胞中PXR mRNA的表達分別上調(diào)了23.86%，69.54%，122.89%及159.28%（P＜0.05）；CYP3A4 mRNA的表達分別上調(diào)了49.65%，101.35%，144.02%及188.87%（P＜0.05），且二者影響趨勢一致（R2=0.9713）。短時間干預(yù)1h，不同濃度的PXT對PXR和CYP3A4蛋白表達均無明顯影

8、響（P＞0.05）。
　　PXT長時間干預(yù)24后，5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的PXT對高表達hPXR的HepG2細胞中PXR mRNA的表達分別上調(diào)了47.80%，87.62%，131.15%、239.80%及361.15%（P＜0.05）；對CYP3A4 mRNA的表達分別上調(diào)了91.93%，139.84%，212.80%、398.28%及642.02%（P＜0.05），且二者影響趨勢一致（R2=0.9959

9、）。長時間干預(yù)24h，除5μM無明顯影響外（P＞0.05），10μM、20μM、40μM、80μM的PXT對高表達hPXR的HepG2細胞中PXR蛋白的表達分別上調(diào)了50.72%，104.73%，167.02%及314.50%（P＜0.05）；對CYP3A4蛋白的表達分別上調(diào)了72.24%，130.27%，193.69%及344.81%（P＜0.05），且二者影響趨勢一致（R2=0.9973）。
　　3.PXT對瞬時共轉(zhuǎn)染hPXR

10、的HepG2細胞中CYP3A4報告基因的影響
　　PXT干預(yù)1h時，5μM濃度對CYP3A4無誘導(dǎo)作用（P＞0.05）。當PXT為10μM、20μM、40μM、80μM時誘導(dǎo)倍數(shù)分別為1.44、1.63、1.79、1.93，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。5μM、10μM、20μM、40μM、80μM的PXT干預(yù)6h時，其誘導(dǎo)倍數(shù)分別為1.42、1.63、2.18、2.69、3.07（P＜0.05）；干預(yù)24h時，誘導(dǎo)倍數(shù)分別為1

11、.90、2.44、2.94、3.61、4.20（P＜0.05）；干預(yù)48h時，誘導(dǎo)倍數(shù)分別為1.56、2.06、2.47、3.08、3.51（P＜0.05）。作用時間從1h、6h、24h、48h，PXT對CYP3A4的誘導(dǎo)作用隨濃度的增大而增大。系列濃度的PXT對HepG2細胞干預(yù)24h時誘導(dǎo)效果最好。PXT與RIF共同作用的誘導(dǎo)效果要大于PXT與RIF的單獨作用。
　　結(jié)論：
　　1.PXT短時間干預(yù)1h，對正常HepG2

12、細胞中PXR和CYP3A4的mRNA的表達有上調(diào)作用，但對PXR和CYP3A4的蛋白表達無明顯影響；長時間干預(yù)24h，對正常HepG2細胞中PXR和CYP3A4的mRNA和蛋白的表達均有上調(diào)作用。且PXT對PXR與CYP3A4二者影響趨勢一致。提示PXT長短時干預(yù)對HepG2細胞中CYP3A4表達的影響可能與PXR通路有關(guān)。
　　2.PXT對高表達hPXR的HepG2細胞長短時干預(yù)結(jié)果與正常HepG2細胞相似。短時間干預(yù)1h只對P