光合細菌生物不對稱加氫催化體系的研究.pdf

1、利用生物轉(zhuǎn)化制備具有實際應(yīng)用價值的高光學純度手性化合物是當前生物技術(shù)中一個具有理論意義和應(yīng)用價值的領(lǐng)域，關(guān)于在生物不對稱加氫過程中利用光能進行不放氧光合作用推動輔酶(NADPH)再生的光合細菌作為催化細胞的研究國內(nèi)外未見相關(guān)報道。本論文以能進行不放氧光合作用的類球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)作為生物催化劑，采用苯乙酮還原轉(zhuǎn)化具有光學活性的苯乙醇的反應(yīng)為模型反應(yīng)，前期實驗證明在最優(yōu)反應(yīng)條件下的發(fā)酵培養(yǎng)基中其產(chǎn)物

2、的收率在90％以上，產(chǎn)物的光學純度更是高達99％。在此基礎(chǔ)上進一步探討了光合細菌生物不對稱加氫催化體系的催化機理及其底物適用范圍;催化體系產(chǎn)物的收率、光學構(gòu)型、ee值的調(diào)控因素;另外為了減少底物對催化細胞的毒害作用，進一步實現(xiàn)光合生物的固定化及其在化學反應(yīng)器中的原位再生，以期實現(xiàn)高光學純度的手性中間體的工業(yè)化生產(chǎn)，我們還研究了水/有機相催化體系。得出如下結(jié)論:
　　1、對光合細菌生物不對稱加氫催化體系的催化條件進行了研究，選擇了同

3、類研究中應(yīng)用最廣的苯乙酮作為反應(yīng)的模型底物，通過前期實驗和相關(guān)文獻查閱，選定對光合細菌生物不對稱加氫催化體系影響最大的三個因素:pH值、底物濃度和催化細胞的菌體濃度作為單因子，考查了它們對催化體系的產(chǎn)物收率和ee值的影響，并在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面方法(Response Surface Methodology，RSM)優(yōu)化催化條件參數(shù)，確定了催化體系的最佳pH值為6.97，最佳底物濃度:17.58 mmol/L，最佳菌體細胞濃度:215 g

4、/L，為工業(yè)化生產(chǎn)制備重要手性中間體奠定理論基礎(chǔ)和實驗指導。
　　2、根據(jù)該催化體系的特點，建立了以氣相色譜(GC)、火焰離子檢測器(FID)作為手段的檢測方法。采用標準圖譜比較和添加產(chǎn)物標準品對照的方法進行定性和定量分析。
　　3、通過制備類球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)的載色體和分離純化的胞內(nèi)氧化還原酶混合液，構(gòu)建了以類球紅桿菌全細胞、S-氧化還原酶和R-氧化還原酶混合液以及載色體與氧化還原酶

5、耦合為生物催化劑的三種不對稱還原反應(yīng)體系，并向反應(yīng)體系中加入能提高產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率的最適氫供體乙酸鈉和電子供體硫代硫酸鈉。通過檢測目標產(chǎn)物的收率、對映體過量(ee)值和光學構(gòu)型，分析了光合細菌生物不對稱加氫的生物催化機理，光照條件下，位于細胞膜載色體上的捕光色素將吸收的光量子傳遞到光化學反應(yīng)中心的菌綠素分子Bch1上，Bch1吸收一個光量子后由基態(tài)轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)Bch1*，Bch1*分子釋放的高能電子經(jīng)過非循環(huán)式光電子傳遞鏈傳遞，還原NADP+

6、為不對稱加氫過程中所必需的輔酶NADPH，通過加入供氫體和供電子體的方式補充NADPH再生所需的活性H和菌綠素分子Bch1失去的電子，這就是上述反應(yīng)中在載色體或全細胞存在時，加入乙酸鈉和硫代硫酸鈉后，反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和ee值大幅提高的原因。光照使得細胞內(nèi)S-氧化還原酶的活性遠高于R-氧化還原酶，此時胞內(nèi)再生的輔酶NADPH同等條件下只能被S-氧化還原酶緊密結(jié)合和利用，而R-氧化還原酶由于活性相對較低，沒有足夠的輔酶可利用。因此光照條件下的e

7、e值遠高于黑暗條件下，并且其產(chǎn)物以S-苯乙醇為主。而黑暗條件下S-氧化還原酶未被激活，無法大量結(jié)合輔酶NADPH，胞內(nèi)S-氧化還原酶和R-氧化還原酶活性差異不大，結(jié)合NADPH的能力也相似，因此反應(yīng)的ee值較低，產(chǎn)物以R-苯乙醇為主，同時由于沒有輔酶NADPH再生所必需的光能的提供，反應(yīng)的產(chǎn)率也較低。
　　4、通過實驗發(fā)現(xiàn)反應(yīng)過程中加入氫供體和電子供體后可以提高產(chǎn)物收率，在闡明生物催化機理的基礎(chǔ)上分析硫代硫酸鈉和乙酸鈉分別為最佳電

8、子供體和最佳氫供體的原因。同時考查了光照和反應(yīng)前對菌體細胞進行熱預處理后產(chǎn)物的光學構(gòu)型和產(chǎn)物收率的變化。試驗結(jié)果表明光照條件下產(chǎn)物是生成S-苯乙醇，黑暗條件下則是生成R-苯乙醇，當熱預處理溫度高于51℃，產(chǎn)物以R-苯乙醇為主，其中在54℃時產(chǎn)物R-苯乙醇的ee值達到最高的93.6％，溫度在51℃以下產(chǎn)物則是以S-苯乙醇為主，其中30℃時產(chǎn)物的ee值為最高的94.0％。
　　5、比較石油醚、環(huán)己烷、正庚烷、正己烷、正辛烷在兩相體系中

9、對催化細胞的生物相容性和對底物、產(chǎn)物的分配性能，確定出兩相體系中的最佳有機溶劑。用該有機溶劑處理類球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)菌體細胞后，通過分光光度計(Ultrospec3300 pro，Amersham Biosciences)對其胞內(nèi)氧化還原酶的酶活進行測定，研究了菌體細胞對最佳有機溶劑的耐受性。其次比較了在水溶液體系和兩相體系中類球紅桿菌(Rhodobacter sphaeroides)細胞催化苯乙

10、酮的不對稱還原反應(yīng)過程。最后，為了優(yōu)化反應(yīng)工藝，分別考察了相體積比、振蕩速度、生物量/底物量之比、反應(yīng)溫度以及反應(yīng)體系的pH值對還原反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)水相與有機溶劑相體積比、振蕩速度、反應(yīng)時間、pH這些因素對反應(yīng)的ee值影響較小，但是對反應(yīng)的產(chǎn)物收率卻有著較大影響。水相pH在7.0有利于反應(yīng)的進行;振蕩速度180 r/min;水與有機溶劑之比在1∶1為最佳;反應(yīng)時間控制在48 h可達到反應(yīng)的最大產(chǎn)物收率。
　　6、通過實驗可以知道光