過表達(dá)蘋果α-法尼烯合酶基因煙草早衰機(jī)制研究.pdf

1、煙草是一年生或有限多年生草本植物，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。因其腺體豐富，具有大量的綠色組織，使其成為萜類代謝工程研究的理想模式植物。
　　α-法尼烯是一種揮發(fā)性倍半萜烯，α-法尼烯合酶是催化α-法尼烯合成的最終限速酶。到目前為止，對蘋果α-法尼烯的研究主要集中在α-法尼烯及其氧化產(chǎn)物-共軛三烯醇類物質(zhì)（Conjugated Trienols，CTols）與蘋果虎皮病發(fā)生的關(guān)系。在植物中過表達(dá)蘋果α-法尼烯合酶基因是否影響其他萜類物質(zhì)的合

2、成及植物生物學(xué)特性的研究相對較少。本研究以過表達(dá)蘋果α-法尼烯合酶基因煙草的T3代植株為實(shí)驗(yàn)材料，通過轉(zhuǎn)錄組分析代謝通路和代謝物，解釋轉(zhuǎn)基因煙草早衰的原因和機(jī)制。主要結(jié)果如下：
　?。?）植物萜類的合成與釋放具有組織器官特異性。MdAFS基因在轉(zhuǎn)基因煙草的莖中表達(dá)量最低，根和葉片次之，花中表達(dá)量最高，是莖的3.6倍。GC/MS分析煙草萜類組分發(fā)現(xiàn)，在根、莖、葉、花中均未檢測到目的產(chǎn)物法尼烯的釋放，但施用鉀離子處理后，煙草花中檢測出

3、法尼烯。
　?。?）機(jī)械損傷，茉莉酸甲酯（MeJA），赤霉素（GA），水楊酸（SA），乙烯利（ETH），4℃，42℃，聚乙二醇-6000（PEG-6000）和H2O2處理明顯誘導(dǎo)了青香蕉蘋果苗MdAFS基因的表達(dá)，其中，4℃處理后MdAFS基因的表達(dá)一直穩(wěn)定在較高水平；傷害處理表現(xiàn)出先升高后下降的規(guī)律；MeJA，GA，SA，ETH，PEG-6000，H2O2和42℃高溫處理表現(xiàn)出某一時(shí)間點(diǎn)爆發(fā)式上調(diào)的特點(diǎn)，42℃處理效果最明顯上調(diào)

4、大約170倍。在實(shí)驗(yàn)條件下青香蕉蘋果苗MdAFS基因的表達(dá)具有節(jié)律性，在照光1h后出現(xiàn)最大表達(dá)量。
　　（3）目前，煙草（NC89）還沒有可利用的全基因組數(shù)據(jù)庫。利用De nove組裝的方法進(jìn)行煙草葉片和頂芽的轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得了249185條unigenes。葉片差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，抗氧化活性分類有26個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本包括APX和CAT，類胡蘿卜素代謝34個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本，質(zhì)體醌代謝14個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本，抗壞血酸鹽代謝10個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本和氮代謝

5、62個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本。
　　（4）與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株有較多的活性氧積累，轉(zhuǎn)基因植株抗氧化防御系統(tǒng)下降，表現(xiàn)為抗氧化酶（APX，CAT和SOD）活性顯著下降，抗氧化物質(zhì)（類胡蘿卜素，多酚和類黃酮）含量顯著下降，并且對光合電子傳遞鏈阻斷劑敵草?。―CMU）處理更加敏感。
　　（5）在轉(zhuǎn)基因植株中茉莉酸（JA），水楊酸（SA）和乙烯（ET）含量顯著下降，乙烯釋放速率降低；油菜素內(nèi)脂（BR）含量顯著增加，細(xì)胞分裂素（CTK）含量沒

6、有明顯變化。
　?。?）光合作用是萜類合成的還原力和原料來源，轉(zhuǎn)基因植株凈光合速率下降，光合作用產(chǎn)物淀粉和可溶性糖含量顯著下降。對光合作用、光合蛋白和碳固定信號(hào)通路分析分別發(fā)現(xiàn)了87，127和195個(gè)下調(diào)轉(zhuǎn)錄本，沒有上調(diào)轉(zhuǎn)錄本。
　?。?）植物萜類的合成與釋放具有時(shí)間特異性（不同發(fā)育時(shí)期），MdAFS基因隨著煙草發(fā)育進(jìn)程表達(dá)量不斷增加，盛花期達(dá)到最高點(diǎn)。不同發(fā)育時(shí)期，萜類合成途徑關(guān)鍵基因與MdAFS基因相關(guān)性分析表明，MdA

7、FS基因與HMGR基因正相關(guān)，其他基因（DXS、DXR、IDI、FPPS和GPPS）負(fù)相關(guān)。
　　（8）轉(zhuǎn)基因株系HMGR1、HMGR2和HMGS基因上調(diào)表達(dá)，HMGR專一性抑制劑洛伐他?。∕EV）處理也表明轉(zhuǎn)基因植株有較高的HMGR轉(zhuǎn)錄水平。轉(zhuǎn)基因株系萜類合成途徑其它關(guān)鍵基因（DXS、DXR、IDI、FPPS和GPPS）下調(diào)表達(dá)，同時(shí)，對DXR專一性抑制劑膦胺霉素（FOS）處理不敏感。
　　（9）轉(zhuǎn)基因株系葉片中，單萜（檸