喉癌中自噬基因Beclinl的表達(dá)及對(duì)順鉑藥敏的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與研究目的
　　喉癌是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著患者的健康，尋找有效的治療方法一直是臨床的迫切需求，在喉癌的治療中，基因治療已成為手術(shù)、化療、放療三大治療外新的治療手段。
　　自噬是細(xì)胞內(nèi)成分被溶酶體降解過程的統(tǒng)稱，在清除損傷或多余的細(xì)胞器，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要作用。自噬可清除損傷的細(xì)胞器，避免如自由基等有毒性物質(zhì)的產(chǎn)生，從而使突變率降低，抑制腫瘤的形成，而自噬的缺陷可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Beclin1基

2、因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的哺乳動(dòng)物的自噬基因，在多種腫瘤中表現(xiàn)為表達(dá)降低和缺失，Beclin1表達(dá)缺失明顯增加肝癌、肺癌和淋
　　本研究通過檢測喉癌組織中自噬基因Beclin1的表達(dá)，探討自噬基因Beclinl與喉癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；研究自噬基因Beclinl在喉癌Hep-2細(xì)胞中表達(dá)增強(qiáng)和缺失對(duì)細(xì)胞體外增殖、自噬、凋亡的作用及對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞順鉑敏感性的影響，探討自噬誘導(dǎo)在喉癌治療中的可行性，為喉癌的基因治療提供新的思路。
　　

3、方法：
　　1．采用免疫組化SP法對(duì)77例喉癌組織和22例正常喉組織進(jìn)行Beclin1蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析Beclin1與喉癌臨床分型、T分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素的相關(guān)性；
　　2．通過RT-PCR法從人正常喉組織中獲得目的基因Beclin1，將其插入真核表達(dá)載體pcDNA3.1中，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1/Beclinl；設(shè)計(jì)針對(duì)Beclinl的特異性RNA干擾序列，構(gòu)建Beclin1基因

4、的小發(fā)夾狀RNA(shRNA)真核表達(dá)質(zhì)粒pSUPER/Beclin1；
　　3．脂質(zhì)體法將重組質(zhì)粒pcDNA3.1/Beclinl和pSUPER/Beclin1轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞株Hep-2，篩選穩(wěn)定表達(dá)株，采用熒光定量RT-PCR及WesternBlot分別在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測轉(zhuǎn)染前后Beclinl、LC3和p62蛋白的表達(dá)變化；流式細(xì)胞儀檢測自噬情況；Hoechs檢測細(xì)胞凋亡；MTT法檢測細(xì)胞的增殖變化；
　　4．順

5、鉑處理Hep-2細(xì)胞后，MDC染色檢測自噬情況；將重組質(zhì)粒pcDNA3.l/Beclinl和pSUPER/Beclin1轉(zhuǎn)染人喉癌細(xì)胞株Hep-2后，順鉑處理，MTT法檢測細(xì)胞的增殖變化。
　　結(jié)果：
　　1。喉癌組織中Beclin1的蛋白表達(dá)陽性率低于正常喉組織(P<0.05)，喉癌中常見Beclinl表達(dá)下調(diào)和缺失；Beclin1表達(dá)與喉癌的臨床分型無關(guān)(P>0.05)，與喉癌的T分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.

6、05)；
　　2．利用PCR分析，酶切鑒定及DNA測序證實(shí)Beclin1基因的表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/Beclin1和RNA干擾質(zhì)粒pSUPER/Beclin1構(gòu)建成功；
　　3．pcDNA3.1/Beclinl轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后，Beclin1，LC3ⅡmRNA和蛋白的表達(dá)顯著提高，p62mRNA和蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.05)，與未轉(zhuǎn)染組相比，凋亡細(xì)胞和自噬細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞生長活性降低；
　　4．pSUP

7、ER/Beclin1轉(zhuǎn)染Hep-2細(xì)胞后，Beclin1、LC3ⅡmRNA和蛋白的表達(dá)明顯降低，p62mRNA和蛋白的表達(dá)顯著增高(P<0.05)，與未轉(zhuǎn)染組相比，凋亡細(xì)胞和自噬細(xì)胞明顯減少，細(xì)胞生長活性增強(qiáng)；
　　5．順鉑處理Hep-2細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)自噬增加，且呈濃度依賴關(guān)系，重組質(zhì)粒pSUPER/Beclin1可以顯著提高Hep-2細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。
　　結(jié)論：
　　自噬基因Beclin1與喉癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，