高分辨率熔解曲線分析技術用于乙醇脫氫酶1B和乙醛脫氫酶2基因的快速分型.pdf

1、背景與目的：
　　 乙醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶(aldehydedehydrogenase，ALDH)是在人體內(nèi)乙醇代謝途徑的兩個關鍵酶，負責催化人體的乙醇分解代謝，即催化乙醇向乙醛轉化以及乙醛向乙酸鹽分解的關鍵酶。ADH的活性增強可以加速乙醇向乙醛轉化，而ALDH活性的降低則使乙醛向乙酸鹽轉化受到限制，同樣使乙醛的濃度顯著增高。乙醛濃度的增加與酒精相關性疾病的發(fā)生發(fā)展有一定關系。

2、ADH和ALDH基因多態(tài)性具有種族特異性，在不同種族人群中分布是不一樣的。據(jù)研究顯示，亞洲人的酒精依賴性疾病主要與ADH1B和ALDH2基因變異密切相關。
　　 ADH1B基因位于4號染色體長臂2區(qū)2帶，ADH1B*1基因在第3號外顯子發(fā)生143G＞A變異，形成ADH1B*2，導致β1亞基的第47位氨基酸從精氨酸(Arginine)轉換為組氨酸(Histidine)從而形成β2，酶活性增高。ALDH2基因位于12號染色體長臂2區(qū)

3、4帶，ALDH2*1基因在第12號外顯子發(fā)生1510G＞A變異，形成ALDH2*2，與此同時，酶的第487位氨基酸由谷氨酸(Glutamicacid)變?yōu)橘嚢彼?Lysine)。野生型ALDH2*1具有ALDH活性，突變型ALDH2*2沒有ALDH酶活性。ADH1B和ALDH2基因的變異會使酶代謝活性改變，導致飲酒在不同種族和個體間酒精代謝發(fā)生改變。這些年來，研究發(fā)現(xiàn)這兩種變異與各個組織器官的癌變，乙醇相關的肝臟病變、遲發(fā)型老人癡呆、冠

4、心病、2型糖尿病并發(fā)癥、血液中膽固醇水平都有不同程度的聯(lián)系。因此，一種準確快速的基因型分析方法對于有關的臨床研究和人群普查等廣闊研究領域是十分必要的。
　　 近年發(fā)展起來的高分辨率熔解曲線分析（High-resolutionmelting，HRM）技術已被證明是一種具有低成本、高通量、速度快、操作簡便、高靈敏度等優(yōu)點的用于基因突變檢測、基因分型和SNP檢測的工具。不同核酸分子的片段長短、堿基組成、GC分布等是不同的，因此在加熱變

5、性后所有的雙鏈DNA分子都會有自己相應的熔解曲線形狀和位置。當PCR擴增目的片段含有突變/SNP時，目的產(chǎn)物經(jīng)過變性-復性會產(chǎn)生異源雙鏈，異源雙鏈中突變/SNP位點是不匹配的，所以雙鏈DNA在升溫過程中先解鏈，此時熒光染料從局部解鏈的雙鏈DNA分子上釋放出來，根據(jù)熒光強度與溫度曲線圖可以判斷是否具有突變/SNP，同時不同的位點和雜合度都會影響熔解曲線的峰形。HRM分析過程中，隨著雙鏈DNA分子的擴增，由于熒光染料結合到重新產(chǎn)生的雙鏈DN

6、A分子，熒光信號不斷的增強。當進入DNA擴增平臺期時，熒光信號同時也進入了平臺期。隨著溫度的不斷升高，DNA雙鏈逐漸解開，結合上的飽和染料被釋放出來，熒光信號逐漸減弱。直到溫度升到95℃，所有的雙鏈DNA分子完全解開，通過檢測熒光值，建立熒光值隨溫度升高的變化過程得到熔解曲線。HRM技術的基本原理就是根據(jù)熔解曲線的差異性來對樣品進行區(qū)分。
　　 以往的變異檢測技術，限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（PCR-RestrictionFra

7、gmentLengthPolymorphism，PCR-RFLP），單鏈構象多態(tài)性分析(Single-StrandConformationPolymorphisms，SSCP)，兩對交叉引物PCR(PCRwithConfrontingTwo-PairPrimers，PCR-CTPP)，擴增產(chǎn)物長度多態(tài)性(AmplifiedProductLengthPolymorphism,APLP)，變性高效液相色譜（DenaturingHighPer

8、formanceLiquidChromatography,DHPLC）等具有一定的局限性，如耗時長，操作繁瑣，準確度低，成本相對較高等。與這些方法相比，HRM分析方法具有一定的優(yōu)勢:成本低，只需飽和染料不需要昂貴的探針;在PCR反應結束后，不需要后續(xù)工作而直接進行熔解曲線反應;快速、高通量，一次可以同時檢測96或384個樣本;閉管操，防止樣本DNA遭受污染;經(jīng)過HRM分析處理后的PCR擴增產(chǎn)物還可以直接進行DNA測序，十分方便快捷。HR

9、M具有較高的敏感性和特異性，目前已廣泛應用于生命科學、醫(yī)學、農(nóng)學、畜牧業(yè)等各個領域的研究工作中?；贖RM上述特點，本研究擬應用HRM技術，建立ADH1B和ALDH2的檢測方法，對預測個體患酒精相關疾病的風險和研究酶變異與酒精相關疾病的關系提供方便，同時為中國南方酒精相關疾病患者的遺傳咨詢、臨床診斷提供有用的信息。
　　 材料與方法：
　　 1.標本:共收集200例全血標本。采用標準的飽和酚/氯仿法提取外周血中的基因組D

10、NA。
　　 2.分子分析方法:
　　 (1)針對ADH1B和ALDH2基因以及143G＞A和1510G＞A變異位點設計PCR擴增體系及優(yōu)化PCR條件。通過DNA測序獲得ADH1B和ALDH2各種基因型樣品。
　　 (2)建立檢測ADH1B和ALDH2基因的高分辨率熔解曲線分析技術。針對ADH1B和ALDH2基因以及143G＞A和1510G＞A變異位點設計HRM分析的引物，利用經(jīng)測序已知的基因型樣品優(yōu)化HRM分析

11、條件，從而建立ADH1B和ALDH2基因的高分辨率熔解曲線分型的分析方法。
　　 (3)根據(jù)HRM的分析結果，從各種基因型中選取一定數(shù)量的樣品進行測序分析，以驗證評價該方法的準確性。并且選取每種ADH1B和ALDH2基因野生純合子和突變純合子各10個樣本進行重復實驗。同時對ADH1B基因的野生純合子和突變純合子樣本進行了2倍稀釋法，進行5個濃度檢測，探討該方法檢測敏感性。
　　 3.統(tǒng)計學分析:對構建的ADH1B和ALD

12、H2基因已知突變分型檢測體系進行準確性和穩(wěn)定性分析。利用部分樣本直接測序?qū)Ρ葋眚炞C其準確性;采用重復性實驗以確定該體系的穩(wěn)定性與準確性。同時分析東莞地區(qū)隨機漢族人群的ADH1B和ALDH2的基因頻率和基因型頻率，并應用x2檢驗該群體樣品是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用的統(tǒng)計學分析軟件為SPSS13.0。
　　 4.實驗結果的綜合分析、總結。
　　 結果：
　　 建立了穩(wěn)定可靠的雙重HRM檢測體系。此

13、體系中，所選取的擴增目的DNA序列以及所設計的引物的特異性高。ADH1B和ALDH2基因的野生純合子G/G，雜合子G/A，突變純合子A/A三種基因型能夠在HRM上進行明顯的區(qū)分。
　　 用盲法分析對該方法進行評價，用此方法分析東莞地區(qū)200份漢族人基因組DNA樣品，從每組基因型中隨機選出部分樣品進行測序?qū)φ?，結果符合率為100％，證實了該方法的準確性很好;進行重復實驗，發(fā)現(xiàn)三次實驗的變異系數(shù)(CV)的范圍從0.021％到0.06

14、2％，證實了該方法的穩(wěn)定性很好。在2倍稀釋試驗中，5個濃度均可以準確分型，可以知道6.25ng濃度仍然可以用于此檢測體系。
　　 x2檢驗結果顯示所選群體符合Hardy-Weinberg平衡，ADH1B與ALDH2基因頻率與以前所報道的數(shù)據(jù)基本符合，從另一個方面說明了該方法的準確性。
　　 結論：
　　 飲酒已被認為是危害人類健康的嚴重危險因素，容易導致多種酒精相關疾病。酒精在體內(nèi)劑量效應和作用時間，不僅僅與酒量

15、和飲酒頻率相關，還與易感基因ADH1B和ALDH2代謝能力有強關聯(lián)性。ADH1B和ALDH2兩種基因的變異與酒精依賴性疾病密切相關，所以對ADH1B和ALDH2兩種基因進行快速分型，在中國人群中進行快速篩查，不僅能夠?qū)凭嚓P疾病風險進行評估，還有助于研究ADH1B和ALDH2基因與其他相關疾病的致病機理。
　　 高分辨率熔解曲線分析技術是近幾年興起一種基于核酸的物理性質(zhì)的基因突變檢測技術。這種檢測技術沒有局限于突變堿基位點與類

16、型，不需使用序列特異性探針，在PCR結束后直接進行高分辨率熔解曲線分析來完成對樣品基因型的分析。HRM因其操作簡便、快速，成本低，結果準確，高通量，并且閉管操作而備受關注。高分辨率熔解曲線分析技術只需要在普通PCR基礎上增加一個飽和染料既可以進行未知突變掃描，也可以對已知突變進行基因分型，還可以分析短片段重復序列。HRM分析的這些優(yōu)勢使它具有極強的可操作性，近年來成為國內(nèi)外新興的各研究領域?qū)W、方法學研究和應用熱點。
　　 本課題

17、研究中建立的針對ADH1B和ALDH2基因的高分辨率熔解曲線分析檢測方法能夠快速、準確地同時對ADH1B和ALDH2基因進行檢測，并且實驗的重復性和穩(wěn)定性好、敏感性高、體系可靠。
　　 本研究對中國南方人群進行檢測，發(fā)現(xiàn)所檢測的200人中不存在ADH1B*1/*1和ALDH2*2/*2組合的個體，所以推測這種基因型組合在中國南方是很少見的。有關文獻報道，ADH1B*1等位基因會增加食道癌，肝癌等癌癥發(fā)生的風險性。同時很多的研究表

18、明ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2個體由于乙醛的積累導致其患有食道癌等癌癥的風險更大，然而同時對這兩個基因進行聯(lián)合研究的很少，因此同時納入ADH1B和ALDH2兩基因的病例-對照研究是下一步進行疾病風險研究的重點工作。
　　 本研究為ADH1B和ALDH2基因的檢測建立了一種簡單、高通量、快速、經(jīng)濟和靈敏的檢測方法，有助于酒精相關疾病的遺傳學咨詢，流行病學調(diào)查，并為研究ADH1B和ALDH2基因與其他相關疾病的關系提供