高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)用于乙醇脫氫酶1B和乙醛脫氫酶2基因的快速分型.pdf

1、背景與目的：
　　 乙醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，ADH）和乙醛脫氫酶(aldehydedehydrogenase，ALDH)是在人體內(nèi)乙醇代謝途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，負(fù)責(zé)催化人體的乙醇分解代謝，即催化乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化以及乙醛向乙酸鹽分解的關(guān)鍵酶。ADH的活性增強(qiáng)可以加速乙醇向乙醛轉(zhuǎn)化，而ALDH活性的降低則使乙醛向乙酸鹽轉(zhuǎn)化受到限制，同樣使乙醛的濃度顯著增高。乙醛濃度的增加與酒精相關(guān)性疾病的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系。

2、ADH和ALDH基因多態(tài)性具有種族特異性，在不同種族人群中分布是不一樣的。據(jù)研究顯示，亞洲人的酒精依賴(lài)性疾病主要與ADH1B和ALDH2基因變異密切相關(guān)。
　　 ADH1B基因位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)2帶，ADH1B*1基因在第3號(hào)外顯子發(fā)生143G＞A變異，形成ADH1B*2，導(dǎo)致β1亞基的第47位氨基酸從精氨酸(Arginine)轉(zhuǎn)換為組氨酸(Histidine)從而形成β2，酶活性增高。ALDH2基因位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū)

3、4帶，ALDH2*1基因在第12號(hào)外顯子發(fā)生1510G＞A變異，形成ALDH2*2，與此同時(shí)，酶的第487位氨基酸由谷氨酸(Glutamicacid)變?yōu)橘?lài)氨酸(Lysine)。野生型ALDH2*1具有ALDH活性，突變型ALDH2*2沒(méi)有ALDH酶活性。ADH1B和ALDH2基因的變異會(huì)使酶代謝活性改變，導(dǎo)致飲酒在不同種族和個(gè)體間酒精代謝發(fā)生改變。這些年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)這兩種變異與各個(gè)組織器官的癌變，乙醇相關(guān)的肝臟病變、遲發(fā)型老人癡呆、冠

4、心病、2型糖尿病并發(fā)癥、血液中膽固醇水平都有不同程度的聯(lián)系。因此，一種準(zhǔn)確快速的基因型分析方法對(duì)于有關(guān)的臨床研究和人群普查等廣闊研究領(lǐng)域是十分必要的。
　　 近年發(fā)展起來(lái)的高分辨率熔解曲線(xiàn)分析（High-resolutionmelting，HRM）技術(shù)已被證明是一種具有低成本、高通量、速度快、操作簡(jiǎn)便、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)的用于基因突變檢測(cè)、基因分型和SNP檢測(cè)的工具。不同核酸分子的片段長(zhǎng)短、堿基組成、GC分布等是不同的，因此在加熱變

5、性后所有的雙鏈DNA分子都會(huì)有自己相應(yīng)的熔解曲線(xiàn)形狀和位置。當(dāng)PCR擴(kuò)增目的片段含有突變/SNP時(shí)，目的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)變性-復(fù)性會(huì)產(chǎn)生異源雙鏈，異源雙鏈中突變/SNP位點(diǎn)是不匹配的，所以雙鏈DNA在升溫過(guò)程中先解鏈，此時(shí)熒光染料從局部解鏈的雙鏈DNA分子上釋放出來(lái)，根據(jù)熒光強(qiáng)度與溫度曲線(xiàn)圖可以判斷是否具有突變/SNP，同時(shí)不同的位點(diǎn)和雜合度都會(huì)影響熔解曲線(xiàn)的峰形。HRM分析過(guò)程中，隨著雙鏈DNA分子的擴(kuò)增，由于熒光染料結(jié)合到重新產(chǎn)生的雙鏈DN

6、A分子，熒光信號(hào)不斷的增強(qiáng)。當(dāng)進(jìn)入DNA擴(kuò)增平臺(tái)期時(shí)，熒光信號(hào)同時(shí)也進(jìn)入了平臺(tái)期。隨著溫度的不斷升高，DNA雙鏈逐漸解開(kāi)，結(jié)合上的飽和染料被釋放出來(lái)，熒光信號(hào)逐漸減弱。直到溫度升到95℃，所有的雙鏈DNA分子完全解開(kāi)，通過(guò)檢測(cè)熒光值，建立熒光值隨溫度升高的變化過(guò)程得到熔解曲線(xiàn)。HRM技術(shù)的基本原理就是根據(jù)熔解曲線(xiàn)的差異性來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分。
　　 以往的變異檢測(cè)技術(shù)，限制性?xún)?nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（PCR-RestrictionFra

7、gmentLengthPolymorphism，PCR-RFLP），單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(Single-StrandConformationPolymorphisms，SSCP)，兩對(duì)交叉引物PCR(PCRwithConfrontingTwo-PairPrimers，PCR-CTPP)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性(AmplifiedProductLengthPolymorphism,APLP)，變性高效液相色譜（DenaturingHighPer

8、formanceLiquidChromatography,DHPLC）等具有一定的局限性，如耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，準(zhǔn)確度低，成本相對(duì)較高等。與這些方法相比，HRM分析方法具有一定的優(yōu)勢(shì):成本低，只需飽和染料不需要昂貴的探針;在PCR反應(yīng)結(jié)束后，不需要后續(xù)工作而直接進(jìn)行熔解曲線(xiàn)反應(yīng);快速、高通量，一次可以同時(shí)檢測(cè)96或384個(gè)樣本;閉管操，防止樣本DNA遭受污染;經(jīng)過(guò)HRM分析處理后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物還可以直接進(jìn)行DNA測(cè)序，十分方便快捷。HR

9、M具有較高的敏感性和特異性，目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、畜牧業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的研究工作中。基于HRM上述特點(diǎn)，本研究擬應(yīng)用HRM技術(shù)，建立ADH1B和ALDH2的檢測(cè)方法，對(duì)預(yù)測(cè)個(gè)體患酒精相關(guān)疾病的風(fēng)險(xiǎn)和研究酶變異與酒精相關(guān)疾病的關(guān)系提供方便，同時(shí)為中國(guó)南方酒精相關(guān)疾病患者的遺傳咨詢(xún)、臨床診斷提供有用的信息。
　　 材料與方法：
　　 1.標(biāo)本:共收集200例全血標(biāo)本。采用標(biāo)準(zhǔn)的飽和酚/氯仿法提取外周血中的基因組D

10、NA。
　　 2.分子分析方法:
　　 (1)針對(duì)ADH1B和ALDH2基因以及143G＞A和1510G＞A變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增體系及優(yōu)化PCR條件。通過(guò)DNA測(cè)序獲得ADH1B和ALDH2各種基因型樣品。
　　 (2)建立檢測(cè)ADH1B和ALDH2基因的高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)。針對(duì)ADH1B和ALDH2基因以及143G＞A和1510G＞A變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)HRM分析的引物，利用經(jīng)測(cè)序已知的基因型樣品優(yōu)化HRM分析

11、條件，從而建立ADH1B和ALDH2基因的高分辨率熔解曲線(xiàn)分型的分析方法。
　　 (3)根據(jù)HRM的分析結(jié)果，從各種基因型中選取一定數(shù)量的樣品進(jìn)行測(cè)序分析，以驗(yàn)證評(píng)價(jià)該方法的準(zhǔn)確性。并且選取每種ADH1B和ALDH2基因野生純合子和突變純合子各10個(gè)樣本進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)對(duì)ADH1B基因的野生純合子和突變純合子樣本進(jìn)行了2倍稀釋法，進(jìn)行5個(gè)濃度檢測(cè)，探討該方法檢測(cè)敏感性。
　　 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:對(duì)構(gòu)建的ADH1B和ALD

12、H2基因已知突變分型檢測(cè)體系進(jìn)行準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性分析。利用部分樣本直接測(cè)序?qū)Ρ葋?lái)驗(yàn)證其準(zhǔn)確性;采用重復(fù)性實(shí)驗(yàn)以確定該體系的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。同時(shí)分析東莞地區(qū)隨機(jī)漢族人群的ADH1B和ALDH2的基因頻率和基因型頻率，并應(yīng)用x2檢驗(yàn)該群體樣品是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS13.0。
　　 4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果的綜合分析、總結(jié)。
　　 結(jié)果：
　　 建立了穩(wěn)定可靠的雙重HRM檢測(cè)體系。此

13、體系中，所選取的擴(kuò)增目的DNA序列以及所設(shè)計(jì)的引物的特異性高。ADH1B和ALDH2基因的野生純合子G/G，雜合子G/A，突變純合子A/A三種基因型能夠在HRM上進(jìn)行明顯的區(qū)分。
　　 用盲法分析對(duì)該方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，用此方法分析東莞地區(qū)200份漢族人基因組DNA樣品，從每組基因型中隨機(jī)選出部分樣品進(jìn)行測(cè)序?qū)φ眨Y(jié)果符合率為100％，證實(shí)了該方法的準(zhǔn)確性很好;進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)三次實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)(CV)的范圍從0.021％到0.06

14、2％，證實(shí)了該方法的穩(wěn)定性很好。在2倍稀釋試驗(yàn)中，5個(gè)濃度均可以準(zhǔn)確分型，可以知道6.25ng濃度仍然可以用于此檢測(cè)體系。
　　 x2檢驗(yàn)結(jié)果顯示所選群體符合Hardy-Weinberg平衡，ADH1B與ALDH2基因頻率與以前所報(bào)道的數(shù)據(jù)基本符合，從另一個(gè)方面說(shuō)明了該方法的準(zhǔn)確性。
　　 結(jié)論：
　　 飲酒已被認(rèn)為是危害人類(lèi)健康的嚴(yán)重危險(xiǎn)因素，容易導(dǎo)致多種酒精相關(guān)疾病。酒精在體內(nèi)劑量效應(yīng)和作用時(shí)間，不僅僅與酒量

15、和飲酒頻率相關(guān)，還與易感基因ADH1B和ALDH2代謝能力有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性。ADH1B和ALDH2兩種基因的變異與酒精依賴(lài)性疾病密切相關(guān)，所以對(duì)ADH1B和ALDH2兩種基因進(jìn)行快速分型，在中國(guó)人群中進(jìn)行快速篩查，不僅能夠?qū)凭嚓P(guān)疾病風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)估，還有助于研究ADH1B和ALDH2基因與其他相關(guān)疾病的致病機(jī)理。
　　 高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)是近幾年興起一種基于核酸的物理性質(zhì)的基因突變檢測(cè)技術(shù)。這種檢測(cè)技術(shù)沒(méi)有局限于突變堿基位點(diǎn)與類(lèi)

16、型，不需使用序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接進(jìn)行高分辨率熔解曲線(xiàn)分析來(lái)完成對(duì)樣品基因型的分析。HRM因其操作簡(jiǎn)便、快速，成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，高通量，并且閉管操作而備受關(guān)注。高分辨率熔解曲線(xiàn)分析技術(shù)只需要在普通PCR基礎(chǔ)上增加一個(gè)飽和染料既可以進(jìn)行未知突變掃描，也可以對(duì)已知突變進(jìn)行基因分型，還可以分析短片段重復(fù)序列。HRM分析的這些優(yōu)勢(shì)使它具有極強(qiáng)的可操作性，近年來(lái)成為國(guó)內(nèi)外新興的各研究領(lǐng)域?qū)W、方法學(xué)研究和應(yīng)用熱點(diǎn)。
　　 本課題

17、研究中建立的針對(duì)ADH1B和ALDH2基因的高分辨率熔解曲線(xiàn)分析檢測(cè)方法能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)對(duì)ADH1B和ALDH2基因進(jìn)行檢測(cè)，并且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和穩(wěn)定性好、敏感性高、體系可靠。
　　 本研究對(duì)中國(guó)南方人群進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所檢測(cè)的200人中不存在A(yíng)DH1B*1/*1和ALDH2*2/*2組合的個(gè)體，所以推測(cè)這種基因型組合在中國(guó)南方是很少見(jiàn)的。有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，ADH1B*1等位基因會(huì)增加食道癌，肝癌等癌癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性。同時(shí)很多的研究表

18、明ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2個(gè)體由于乙醛的積累導(dǎo)致其患有食道癌等癌癥的風(fēng)險(xiǎn)更大，然而同時(shí)對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行聯(lián)合研究的很少，因此同時(shí)納入ADH1B和ALDH2兩基因的病例-對(duì)照研究是下一步進(jìn)行疾病風(fēng)險(xiǎn)研究的重點(diǎn)工作。
　　 本研究為ADH1B和ALDH2基因的檢測(cè)建立了一種簡(jiǎn)單、高通量、快速、經(jīng)濟(jì)和靈敏的檢測(cè)方法，有助于酒精相關(guān)疾病的遺傳學(xué)咨詢(xún)，流行病學(xué)調(diào)查，并為研究ADH1B和ALDH2基因與其他相關(guān)疾病的關(guān)系提供