Ser-313低磷酸化IκBβ對(duì)膿毒癥肺損傷保護(hù)作用的研究.pdf

1、膿毒癥是由各種直接或間接感染因素引起的全身性免疫及炎癥反應(yīng)，層級(jí)放大的反應(yīng)程度?？梢鸲嗯K器功能障礙甚至衰竭。作為機(jī)體氣體交換中心的肺臟對(duì)炎癥反應(yīng)敏感，膿毒癥導(dǎo)致的肺損傷?？蓭?lái)致命后果。膿毒癥所致的肺損傷通常為急性炎癥性肺損傷，以肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主要表現(xiàn)，膿毒癥時(shí)因?yàn)闄C(jī)體調(diào)控出現(xiàn)紊亂，過(guò)度放大的炎癥反應(yīng)可加重肺損傷，而且我們認(rèn)為此時(shí)中性粒細(xì)胞趨化的適度減弱反而對(duì)臟器保護(hù)有利。因此探尋減輕膿毒癥肺損傷肺部炎癥反應(yīng)的途徑是一個(gè)可行的保護(hù)

2、膿毒癥后肺臟的方法。
　　NF-κB是重要的核基因轉(zhuǎn)錄因子。正常細(xì)胞中NF-κB二聚體與NF-κB抑制蛋白(IκB)相結(jié)合，以無(wú)活性形式分布于胞漿中。受到LPS刺激后，IκB被降解并活化NF-KB，使其移位到細(xì)胞核發(fā)揮調(diào)控基因表達(dá)的作用。IκBβ蛋白的磷酸化和去磷酸化是其功能調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。有研究發(fā)現(xiàn)IκBβ敲除后的小鼠對(duì)過(guò)度炎癥反應(yīng)所致臟器功能損傷的保護(hù)能力顯著下降。這間接說(shuō)明IκBβ可能對(duì)過(guò)度炎癥反應(yīng)造成的臟器損傷有保護(hù)作用。

3、r>　　正常的IκBβ的C端(|)有2個(gè)酪蛋白激酶（casein kinase）活化的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)Ser-313和Ser-315，細(xì)胞受到LPS刺激時(shí)，這種兩個(gè)位點(diǎn)均磷酸化的IκBβ蛋白降解，隨后啟動(dòng)再合成過(guò)程，但再合成的IκBβ處于低磷酸化狀態(tài)，它與細(xì)胞核中游離的NF-κB結(jié)合，與之持續(xù)作用。由此看來(lái)，Ser-313或Ser-315位點(diǎn)低磷酸化的IκBβ可能對(duì)NF-κB相關(guān)通路引起的針對(duì)內(nèi)源性和外源性毒素的免疫應(yīng)答存在作用。Ser

4、-313低磷酸化的IκBβ對(duì)趨化因子是否有調(diào)控作用未見(jiàn)明確報(bào)道。通過(guò)Ser-313位點(diǎn)突變，使Ser-313位無(wú)法磷酸化生成低磷酸化IκBβ，可以針對(duì)這些設(shè)想進(jìn)行研究。我們構(gòu)建了過(guò)表達(dá)Ser-313低磷酸化IκBβ的轉(zhuǎn)基因小鼠，建立其膿毒癥模型后對(duì)Ser-313低磷酸化IκBβ的存在、分布和對(duì)炎癥的調(diào)控、膿毒癥后小鼠死亡率、膿毒癥肺損傷的評(píng)估及肺部中性粒細(xì)胞趨化進(jìn)行研究，模擬臨床患者膿毒癥的過(guò)程，以期揭示Ser-313低磷酸化的IκBβ

5、在機(jī)體膿毒癥后對(duì)肺損傷的保護(hù)作用和其機(jī)制。
　　第一部分 Ser-313低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠構(gòu)建、低磷酸化IκBβ相關(guān)研究及其對(duì)膿毒癥小鼠的保護(hù)作用
　　研究目的:對(duì)Ser-313低磷酸化IκBβ的表達(dá)、分布進(jìn)行探究;初步研究其對(duì)膿毒癥后全身炎癥反應(yīng)的作用;通過(guò)死亡率探究其對(duì)膿毒癥后小鼠的保護(hù)作用。
　　研究方法:構(gòu)建Ser-313點(diǎn)突變而使該位不能磷酸化的低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠。建立小鼠的由盲腸結(jié)扎穿刺(C

6、LP)導(dǎo)致的膿毒癥模型。對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型小鼠膿毒癥模型后組織行IκBβ基因轉(zhuǎn)錄及蛋白的檢測(cè)。針對(duì)IκBβ進(jìn)行免疫共沉淀檢測(cè)。研究轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的死亡率。對(duì)膿毒癥模型后小鼠循環(huán)內(nèi)的兩種主要炎癥因子TNF-α和IL-6進(jìn)行檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:成功構(gòu)建Ser-313低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠，自行繁殖、鑒定，并驗(yàn)證其可持續(xù)表達(dá)Ser-313低磷酸化的IκBβ。建立小鼠CLP膿毒癥模型，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率顯著優(yōu)于野生型小鼠，

7、術(shù)后24小時(shí)，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率分別是60％和100％，術(shù)后64小時(shí)，野生型小鼠完全死亡，轉(zhuǎn)基因小鼠的生存率達(dá)到50％。發(fā)現(xiàn)在野生型小鼠CLP后，組織內(nèi)Ser-313位磷酸化的IκBβ占總IκBβ的比值分別為3h-0，6h-17.5％，12h-54.1％，24h-73.9％，說(shuō)明膿毒癥早期正常的IκBβ均被降解，新合成的IκBβ大多是Ser-313低磷酸化的IBβ。膿毒癥后野生型小鼠組織中IκBβmRNA的水平穩(wěn)定地增加，在術(shù)后

8、12小時(shí)達(dá)到極大值，與膿毒癥后總IκBβ蛋白量的變化趨勢(shì)相符。發(fā)現(xiàn)Ser-313低磷酸化IκBβ在細(xì)胞核內(nèi)與p105/p50，p65(Rel A)和Rel B4種NF-κB蛋白存在相互作用，與c-Rel之間可能不存在相互作用。發(fā)現(xiàn)Ser-313低磷酸化IκBβ的轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥后血清中TNFα和IL-6濃度均較野生型小鼠低，說(shuō)明Ser-313低磷酸化的IκBβ能夠降低促炎細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　研究結(jié)論: Ser-313低磷酸化Iκ

9、Bβ在細(xì)胞核內(nèi)與p105/p50，p65(Rel A)和Rel B存在相互作用;能降低小鼠膿毒癥后死亡率，調(diào)控炎癥反應(yīng)。
　　第二部分 Ser-313低磷酸化IκBβ通過(guò)調(diào)控小鼠膿毒癥后促炎趨化作用而對(duì)膿毒癥肺損傷起保護(hù)作用
　　研究目的:探索Ser-313低磷酸化IκBβ對(duì)膿毒癥后小鼠肺組織的保護(hù)效果;探索其與膿毒癥后肺組織炎癥細(xì)胞趨化的關(guān)系。
　　研究方法:對(duì)兩種小鼠膿毒癥后的肺部組織行HE染色觀察肺部損傷程度，進(jìn)

10、行肺損傷評(píng)分。測(cè)定肺組織干濕比。對(duì)肺組織切片行CD11b免疫組化染色。制備兩種小鼠肺組織基因芯片，對(duì)基因芯片提示有表達(dá)量變化的主要趨化因子進(jìn)行realtime PCR檢測(cè)。選取最主要的中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL1和CXCL2進(jìn)行肺組織蛋白的ELISA檢測(cè)和Western Blotting檢測(cè)。
　　研究結(jié)果:發(fā)現(xiàn)Ser-313低磷酸化IκBβ轉(zhuǎn)基因小鼠CLP后肺損傷較野生型小鼠明顯減輕，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少。CLP術(shù)后24h時(shí)，野生

11、型小鼠的肺損傷評(píng)分明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠（10分vs6分，p＜0.01），肺干濕比野生型小鼠vs轉(zhuǎn)基因小鼠為3.79±0.12vs2.56±0.11(n=3，p＜0.01)。CD11b免疫組化染色表明轉(zhuǎn)基因小鼠在膿毒癥后肺部中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較野生型小鼠少。兩種小鼠CLP術(shù)后12小時(shí)肺組織基因芯片KEGG富集分析顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥后在趨化因子信號(hào)通路的基因轉(zhuǎn)錄明顯低于于野生型小鼠，最主要的中性粒細(xì)胞趨化因子CXCL1和CXCL2均相對(duì)于野生

12、型小鼠轉(zhuǎn)錄下調(diào)。小鼠肺組織Realtime PCR檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)基因小鼠膿毒癥后肺組織9種趨化因子mRNA的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，結(jié)果與基因芯片相似。ELISA和Western Blotting的結(jié)果基本一致，證實(shí)兩種小鼠CLP后中性粒細(xì)胞的主要趨化因子CXCL1和CXCL2表達(dá)差異明顯，在CLP術(shù)后6小時(shí)和12小時(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)均明顯低于野生型小鼠。
　　研究結(jié)論:Ser-313低磷酸化的IκBβ對(duì)小鼠膿毒癥肺損傷有明確的保護(hù)作用。其保護(hù)機(jī)制