AF-1與UG結(jié)合蛋白相互作用及生物學(xué)意義的初步研究.pdf

1、子宮珠蛋白(uteroglobin,UG)是一種具有多種生物活性的小分子分泌性蛋白。在呼吸系統(tǒng),UG主要由襯覆于遠(yuǎn)端細(xì)支氣管的非纖毛上皮細(xì)胞Clara細(xì)胞所分泌,因此也稱為Clara細(xì)胞分泌蛋白(Clara cell secretoryprotein,CCSP)、Clara細(xì)胞蛋白10(CC10)等。UG新近被正式確定為分泌珠蛋白家族成員1A1(secretoglobin,family 1A,member 1,SCGB1A1)。

2、　　UG最早在兔的子宮內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)并由此命名,研究顯示,子宮、胸腺、垂體、肺、胃腸道、胰腺、乳腺、前列腺等多種組織均可表達(dá)UG,但以肺和支氣管的表達(dá)水平最高,其在肺內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度可比前列腺、子宮內(nèi)膜等組織高20倍。UG具有抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)侵襲、抑制成纖維細(xì)胞趨化、抑制TH2細(xì)胞活化等多種生物活性。UG作為肺內(nèi)源性保護(hù)因子已經(jīng)日益受到重視,并有望成為某些疾病治療的有效手段。
　　Antiflammins(簡(jiǎn)稱AF

3、s)是與UG的第三個(gè)α螺旋中的保守序列以及脂皮素序列中的某些保守序列高度同源的一類寡肽的統(tǒng)稱,由于最初發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)具有強(qiáng)的抗炎作用而命名。其中,Antiflammin-1(簡(jiǎn)稱AF-1)對(duì)應(yīng)于UG分子中第39-47位的氨基酸(MQMKKVLDS),由疏水氨基酸殘基組成,其C端的氨基酸殘基Lys和Asp分別對(duì)應(yīng)于UG的第43位Lys和第46位Asp。AF-1具有強(qiáng)的抗炎及抑制黏附等多種與UG全長(zhǎng)蛋白相似的生物活性。與大分子天然蛋白相比,活性

4、寡肽分子量更小,具有更低免疫原性和潛在的應(yīng)用前景。肺纖維化是嚴(yán)重危害健康的呼吸系統(tǒng)常見并發(fā)癥,是多種病因不同的肺間質(zhì)疾病的最后共同結(jié)局。肺纖維化的發(fā)病率和死亡率呈逐漸上升趨勢(shì),五年存活率不足50％。肺纖維化的發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)未闡明,至今仍無(wú)特效的治療方法,目前多種抗肺纖維化的治療并未能有效地改善其不良預(yù)后。探討新的肺纖維化治療的途徑,是肺纖維化研究的活躍領(lǐng)域。目前對(duì)肺纖維化發(fā)生的研究,主要集中在促纖維化機(jī)制的研究,對(duì)肺纖維化負(fù)性調(diào)控機(jī)制的研究

5、較少。
　　本室研究曾首次證實(shí)肺內(nèi)分泌UG的Clara細(xì)胞具有抗肺纖維化的效應(yīng),提示了UG對(duì)肺纖維化進(jìn)程的負(fù)性調(diào)控作用。隨后有研究表明,UG基因敲除小鼠更易發(fā)展成為肺纖維化,進(jìn)一步提示了UG的抗肺纖維化效應(yīng)。UG可能是肺內(nèi)天然存在的肺纖維化負(fù)性調(diào)控因子。但目前UG及其活性片段生物學(xué)作用的機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。
　　UG的生物學(xué)作用可能有賴于子宮珠蛋白結(jié)合蛋白(UG結(jié)合蛋白,Uteroglobin-binding protein,U

6、GBP)的介導(dǎo),但目前對(duì)UGBP的基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能還了解甚少。Kundu等曾用Affinity cross-linking方法在小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3和某些鼠的癌細(xì)胞上先后發(fā)現(xiàn)了兩種UG的結(jié)合蛋白。DiazGonzalez和Nieto等通過Gel filtration也發(fā)現(xiàn)過另外可以結(jié)合UG的蛋白質(zhì)。然而,由于這些結(jié)合蛋白在當(dāng)時(shí)均未被克隆和鑒定,這些表觀分子大小不同的蛋白究竟屬于同一種蛋白的不同亞基或者多聚體還是完全不同的蛋白質(zhì)

7、并不清楚,它們之間的關(guān)系也不明確。小鼠的UG結(jié)合蛋白(uteroglobin-binding protein,UGBP,也稱UG受體,uteroglobin receptor)基因于2001年克隆。生物信息學(xué)分析顯示UGBP可能是具有9次跨膜結(jié)構(gòu)的膜蛋白。
　　目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)UGBP的基因結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能了解甚少,對(duì)其研究均遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于對(duì)其天然配體UG的研究,這將限制對(duì)UG生物學(xué)功能的全面深入的認(rèn)識(shí),也必將限制其可能的臨床應(yīng)用。因此

8、,針對(duì)目前UG結(jié)合蛋白研究滯后這一現(xiàn)狀而進(jìn)行探索性研究具有重要意義。由于Antiflammin-1(AF-1)是源于UG的C端保守序列的寡肽,對(duì)應(yīng)于UG的第3個(gè)α螺旋的第39-47位氨基酸序列,具有與UG全長(zhǎng)蛋白相似的生物活性,文獻(xiàn)報(bào)道,第3個(gè)α螺旋是UG與其他蛋白相互作用的部位,因此,研究AF-1與UGBP的相互作用及意義十分必要。探討UGBP與其配體的相互作用的特點(diǎn)及意義,將有助于進(jìn)一步闡明UG及其活性片段生物學(xué)作用的機(jī)制,并為UG

9、及衍生物可能的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　本文共分為四章。在對(duì)小鼠UG結(jié)合蛋白(mUGBP)進(jìn)行生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)的基礎(chǔ)上,本研究對(duì)mUGBP的亞細(xì)胞定位、UG的C端寡肽AF-1與mUGBP蛋白在活細(xì)胞上的結(jié)合特性、對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化的影響,以及生物學(xué)意義等方面進(jìn)行了初步探討。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用RT-PCR方法進(jìn)行了mUGBP cDNA的克隆,將mUGBP cDNA克隆至真核表達(dá)載

10、體pEGFP-N1,構(gòu)建了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白與小鼠UG結(jié)合蛋白——mUGBP的融合表達(dá)載體pUGBP-EGFP。用GFP標(biāo)簽技術(shù)對(duì)mUGBP蛋白在COS-1細(xì)胞中的定位進(jìn)行了研究。同時(shí),本研究制備了兔抗mUGBP蛋白的多克隆抗體,用制備的mUGBP抗體對(duì)已經(jīng)證實(shí)的有mUGBP基因表達(dá)的小鼠成纖維細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞進(jìn)行亞組分Western blot分析和免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),mUGBP蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)膜組分中表達(dá)。
　　2.在本文第

11、二部分的研究中,用熒光染料Cy5標(biāo)記了AF-1,與克隆至綠色熒光載體的mUGBP蛋白在COS-1細(xì)胞中進(jìn)行了共定位研究。在培養(yǎng)條件下直接用激光共聚焦鏡觀察發(fā)現(xiàn),mUGBP與EGFP融合蛋白的表達(dá)和Cy5-AF-1呈完全共定位關(guān)系,提示了AF-1與mUGBP在活細(xì)胞上可相互結(jié)合的性質(zhì);進(jìn)而,用熒光染料Cy5標(biāo)記的寡肽AF-1作為探針,用流式細(xì)胞分析方法檢測(cè)了AF-1與mUGBP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞——小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3之間的結(jié)合,在完整細(xì)

12、胞上進(jìn)行的FACS配體結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,AF-1與NIH3T3細(xì)胞之間的結(jié)合具有競(jìng)爭(zhēng)抑制的特征。AF-1與mUGBP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞NIH3T3結(jié)合的Kd值在29.19~46.33nM之間,具有較高親和力。Scatchard作圖呈線性,結(jié)合符合簡(jiǎn)單位點(diǎn)系統(tǒng)的特征。AF-1與mUGBP具有相互結(jié)合特性的初步明確,為進(jìn)一步探討二者相互作用的意義及對(duì)細(xì)胞功能的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　3.本研究的第三部分探討了AF-1對(duì)成纖維細(xì)胞NIH 3

13、T3細(xì)胞內(nèi)ERK1/2磷酸化的影響,并以磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)水平的改變作為AF-1與mUGBP相互作用后的一種的細(xì)胞效應(yīng),檢測(cè)了mUGBP蛋白表達(dá)水平與ERK1/2磷酸化水平之間的關(guān)系。研究結(jié)果表明,AF-1可以增加mUGBP陽(yáng)性表達(dá)的NIH3T3細(xì)胞內(nèi)磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)水平,劑量依賴關(guān)系及時(shí)間依賴關(guān)系明顯。AF-1可以同時(shí)激活ERK1和ERK2,但在同樣的條件下p42 MAPK(ERK2)可以被更多更有效地激活。構(gòu)建并

14、篩選到有效抑制mUGBP表達(dá)的shRNA真核表達(dá)載體,觀察了用pShUGBP敲減mUGBP表達(dá)后對(duì)NIH3T3細(xì)胞磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響,發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pShUGBP的NIH3T3細(xì)胞磷酸化ERK1/2蛋白的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組細(xì)胞,首次提示了mUGBP與AF-1介導(dǎo)的小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞內(nèi)ERK磷酸化改變之間的關(guān)聯(lián)。此外,用Real time PCR array方法在小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3上篩選到敲減mUG

15、BP基因表達(dá)后Mdm2、Egr1、Fos等差異表達(dá)的信號(hào)通路分子,為揭示mUGBP相關(guān)的信號(hào)通路和進(jìn)一步的功能研究提供了啟示。
　　4.本文的第四部分研究了mUGBP在小鼠肺纖維化模型肺組織內(nèi)的表達(dá)變化特點(diǎn),首次發(fā)現(xiàn)mUGBP在正常與肺纖維化肺組織之間存在表達(dá)差異。但是,mUGBP在肺纖維化時(shí)表達(dá)上調(diào)和分布不均一特點(diǎn)的生物學(xué)意義目前還不明確。在小鼠成纖維細(xì)胞系NIH 3T3上的初步研究結(jié)果表明,AF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)

16、胞膠原表達(dá)的抑制效應(yīng)與mUGBP的表達(dá)水平關(guān)系密切,提示mUGBP表達(dá)水平可能與不同條件下細(xì)胞對(duì)配體反應(yīng)性不同相關(guān),但相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　結(jié)論:①mUGBP蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)膜上;②UG活性片段AF-1可與完整活細(xì)胞上mUGBP特異性結(jié)合,其結(jié)合符合簡(jiǎn)單位點(diǎn)系統(tǒng)的特征,可被競(jìng)爭(zhēng)抑制,Kd值在29.19~46.33nM之間,具有較高親和力;③AF-1通過mUGBP的介導(dǎo)可影響小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3細(xì)胞內(nèi)ERK磷

17、酸化水平:④mUGBP在正常與肺纖維化肺組織之間存在表達(dá)差異。AF-1對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞膠原表達(dá)的抑制效應(yīng)與mUGBP的表達(dá)水平關(guān)系密切。以上研究結(jié)果首次表明,小鼠UG結(jié)合蛋白(mUGBP)主要在質(zhì)膜表達(dá),UG活性片段AF-1在完整活細(xì)胞上與mUGBP特異結(jié)合,并引起信號(hào)通路分子ERK1/2磷酸化水平的改變。上述結(jié)論進(jìn)一步支持UGBP作為AF-1功能受體的假說,相關(guān)機(jī)制和功能意義值得進(jìn)一步研究探討。mUGBP在正常與肺纖維化