海藻糖生產(chǎn)菌cDNA文庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、該試驗(yàn)通過(guò)采用熱酸性酚法、TRIZOL法、經(jīng)典總RNA提取法、E.Z.N.A Yeast RNA Kit法四種方法,對(duì)釀酒酵母AS2.1416的總RNA的提取進(jìn)行對(duì)比研究,以期獲得高質(zhì)量的總RNA.并以采用SA-PMPs法從總RNA中提取的mRNA作為模版,在AMV反轉(zhuǎn)錄酶等一系列酶的作用下合成雙鏈cDNA分子.進(jìn)而將獲得的雙鏈cDNA分子與適當(dāng)?shù)你暯幼酉噙B后與經(jīng)過(guò)酶切的具有相同粘性末端的pUC18載體連接,然后將連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大

2、腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞,取適量將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞平鋪在涂有IPTG(20％)和X-gal(2％)的LB固體平板上,從而得到釀酒酵母AS2.1416的cDNA文庫(kù).接著以擴(kuò)增文庫(kù)中重組質(zhì)粒為模版,根據(jù)已發(fā)表的tps1的序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將PCR產(chǎn)物與tps1序列進(jìn)行同源性分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:1)以A<,260>值計(jì)算酵母總RNA產(chǎn)量,熱酸性酚法、TRIZOL法,經(jīng)典總RNA提取法、E.Z.N.A Yeas

3、t RNA Kit法總RNA三次平均產(chǎn)量分別為1.2μg/μl、0.48μg/μl、0.324μg/μl、1.072μg/μl.其中以熱酸性酚法和E.Z.N.A Yeast RNA Kit法得率較高,每毫升培養(yǎng)液分別獲得36μg和32.16μgRNA,其余兩種方法較低,分別獲得14.4μg和9.72μg RNA.而且采用熱酸性酚法得到的總RNA純度較高,其A<,260>/A<,280>可達(dá)1.917、A<,260>/A<,230>可達(dá)2

4、.034,電泳圖譜可看到3條明顯條帶,明顯優(yōu)于其它3種提取方法.2)采用SA-PMPs法能夠有效地從總RNA中分離提純mRNA,分離純化得到mRNA的量為0.41μg,產(chǎn)率約為1.14％,平均A<,260>/A<,280>1.977,純度較高,能夠滿足構(gòu)建高質(zhì)量cDNA文庫(kù)的要求.3)將反轉(zhuǎn)錄合成的雙鏈cDNA經(jīng)過(guò)分級(jí)分離純化后,測(cè)得cDNA含量20.09ng,產(chǎn)率約為4.9％.4)首次使用pUC18質(zhì)粒載體成功地構(gòu)建了釀酒酵母As2.

5、1416的cDNA文庫(kù).該文庫(kù)的重組率達(dá)到96％,庫(kù)容量達(dá)到1.1*10<'9>,文庫(kù)中cDNA片段大小介于0.4*10<'3>-5.5*10<'3>bp.該文庫(kù)的構(gòu)建為進(jìn)一步在分子水平上篩選目的基因及亞克隆奠定了基礎(chǔ).5)通過(guò)對(duì)發(fā)表的tps1基因的分析,設(shè)計(jì)PCR引物,以構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中的cDNA克隆為模版,通過(guò)PCR擴(kuò)增及對(duì)其特異產(chǎn)物的克隆、酶切鑒定和核苷酸測(cè)序,成功地從文庫(kù)中篩選并克隆到長(zhǎng)約1.4kb的一段DNA序列,經(jīng)同源性