農桿菌介導的大麗輪枝菌的遺傳轉化.pdf

1、棉花黃萎病菌引起的棉花黃萎病（Vercicillium wilt）是棉花生產上一種嚴重的真菌病害，在世界主要棉花產區(qū)都曾造成過嚴重的經濟損失。我國屬于產棉大國，多年以來一直受到黃萎病的困擾，在我國發(fā)現的致病菌為大麗輪枝菌（Verticillium dahlia）。目前，致病相關基因功能研究的最直接的方法是通過創(chuàng)建該基因的確是突變體，進一步觀察突變體表型上的變化，進而推測該基因的功能。農桿菌介導（Agrobacteriumtumefaci

2、ens-mediated transformation，ATMT）的遺傳轉化技術，以其特有的有點成為研究真菌與其寄主互作的有力工具。
　　 本研究利用ATMT 技術，創(chuàng)建了大麗輪枝菌V-190的突變體，并對部分突變體進行了分析，具體結果如下：
　　 （1）本文對大麗輪枝菌V-190 遺傳轉化的關鍵條件、因素和參數進行了摸索和優(yōu)化，確定了最適篩選轉化子的潮霉素濃度為50μg/mL，頭孢噻肟鈉與羧卞青霉素對農桿菌有效抑制的濃

3、度為200/200μg/mL。確定了共培養(yǎng)最佳方式是將萌發(fā)的大麗輪枝菌分生孢子與農桿菌混合物25℃共培養(yǎng)于Fries 培養(yǎng)基中，共培養(yǎng)的最佳時間為2d，從接種病斑上分離并萌發(fā)的分生孢子作為轉化受體的轉化效率最高。應用最適的轉化條件，最終平均獲得20～30個轉化子/105分生孢子。
　　 （2）實驗對所得的部分轉化子進行了PCR 驗證。根據T-DNA上已知潮霉素基因序列設計引物進行PCR，檢測結果發(fā)現所檢測的轉化子均含有目的潮霉素