Intelectin基因在哮喘氣道上皮細(xì)胞固有免疫細(xì)胞因子IL-25、IL-33和TSLP表達(dá)中的作用.pdf

1、第一部分Intelectin基因在哮喘的氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、粘液分泌及T淋巴細(xì)胞分化中的作用
　　目的：觀察Intelectin（ITLN）基因在小鼠哮喘模型中對(duì)氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、粘液分泌的影響，并探究其在哮喘T淋巴細(xì)胞分化中的作用。
　　方法：我們選擇C57BL/6J品系的小鼠構(gòu)建ITLN shRNA轉(zhuǎn)基因小鼠（即ITLN KD小鼠），并構(gòu)建卵清蛋白（OVA）和屋塵螨（HDM）兩種哮喘模型。通過(guò)小鼠肺功能儀檢測(cè)哮

2、喘模型中各組小鼠在不同濃度乙酰甲膽堿的激發(fā)下表現(xiàn)出的氣道阻力，并計(jì)數(shù)肺泡灌洗液（BALF）中的細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的分類計(jì)數(shù)。此外，我們根據(jù)小鼠肺組織石蠟切片的HE染色，對(duì)小鼠氣道周?chē)仔约?xì)胞的浸潤(rùn)程度進(jìn)行評(píng)分，比較各組小鼠的氣道炎癥情況。對(duì)粘液分泌的評(píng)估我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(realtime-PCR)法檢測(cè)小鼠肺組織中粘液表達(dá)基因 Muc5ac的mRNA表達(dá)水平、免疫組化法檢測(cè)小鼠肺組織石蠟切片中Muc5ac的蛋

3、白表達(dá)水平及小鼠肺組織石蠟切片糖原染色（PAS）等方法。還用ELISA法檢測(cè)了各組小鼠外周血中OVA特異性 IgE的含量。為探究ITLN在支氣管哮喘T淋巴細(xì)胞分化中的作用，我們首先將各組小鼠肺組織勻漿提取RNA，用realtime-PCR法檢測(cè)各組小鼠肺組織中Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)水平，再用ELISA法檢測(cè)BALF中這些Th2型細(xì)胞因子的濃度。為進(jìn)一步驗(yàn)證ITLN參與了哮喘Th2細(xì)胞分化，我們采用流

4、式細(xì)胞術(shù)標(biāo)記各組小鼠肺組織及縱隔淋巴結(jié)中T細(xì)胞亞群，并比較各組小鼠肺組織及縱隔淋巴結(jié)中Th2型細(xì)胞（IL-4+CD4+）的比例。
　　結(jié)果：在小鼠OVA哮喘模型中，野生型（WT）哮喘組小鼠在對(duì)不同濃度乙酰甲膽堿激發(fā)時(shí)氣道阻力顯著升高，而ITLN KD哮喘組的氣道阻力與WT哮喘組相比明顯下降。在對(duì)各組小鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)后發(fā)現(xiàn)，ITLN KD哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)均明顯低于WT哮喘組。小鼠肺組織HE染色的氣道炎癥評(píng)

5、分結(jié)果提示，ITLN KD哮喘組的炎癥評(píng)分比WT哮喘組的下降50％以上。對(duì)粘液分泌的評(píng)估結(jié)果顯示與WT哮喘組相比，ITLN KD哮喘組在Muc5ac的mRNA及蛋白表達(dá)水平、PAS染色的陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)上均明顯低于WT哮喘組。此外，我們還發(fā)現(xiàn)OVA特異性 IgE含量在WT哮喘組的外周血中顯著升高，而在ITLN KD哮喘組中的表達(dá)明顯被抑制。在HDM小鼠哮喘模型中，氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥和粘液分泌均得到了與 OVA哮喘模型相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在探

6、究ITLN在支氣管哮喘T淋巴細(xì)胞分化中的作用時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，OVA哮喘模型中WT哮喘組Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高，而在ITLN的表達(dá)被抑制后，這些Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)明顯下降。我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群時(shí)發(fā)現(xiàn)，WT哮喘組肺組織及縱隔淋巴結(jié)中Th2型細(xì)胞（IL-4+CD4+）比例較正常對(duì)照組顯著升高，而在ITLN KD哮喘組中Th2型細(xì)胞比例較WT哮喘組明顯下降。
　　結(jié)論

7、：ITLN基因參與哮喘的氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥、粘液分泌等病理過(guò)程，當(dāng)ITLN的表達(dá)被抑制后，哮喘的氣道反應(yīng)性降低，氣道炎癥及粘液分泌均明顯減輕。抑制ITLN的表達(dá)能使CD4+T淋巴細(xì)胞向Th2型細(xì)胞分化減少。
　　第二部分 Intelectin基因在哮喘氣道上皮細(xì)胞固有免疫細(xì)胞因子IL-25、IL-33和TSLP表達(dá)中的作用及機(jī)制
　　目的：探究Intelectin（ITLN）基因在哮喘中對(duì)氣道上皮細(xì)胞固有免疫細(xì)胞因子IL

8、-25、IL-33和 TSLP表達(dá)的影響，并深入研究 ITLN是通過(guò)何種信號(hào)通路參與調(diào)控屋塵螨（HDM）誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-25、IL-33和TSLP的表達(dá)。
　　方法：我們利用第一部分的小鼠哮喘模型標(biāo)本，將各組小鼠肺組織勻漿后取上清，用ELISA法檢測(cè)IL-25、IL-33和TSLP的蛋白表達(dá)水平。為了驗(yàn)證ITLN在致敏早期即參與調(diào)控氣道上皮細(xì)胞因子IL-25、IL-33和TSLP的表達(dá)，我們用屋塵螨（HDM）連續(xù)三天致敏小

9、鼠，檢測(cè)肺組織中ITLN、IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表達(dá)水平。隨后，我們用HDM刺激人支氣管氣道上皮細(xì)胞株（BEAS-2B），檢測(cè)ITLN及IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表達(dá)水平，并設(shè)計(jì)人的ITLN shRNA質(zhì)粒，觀察ITLN的表達(dá)被抑制后，HDM誘導(dǎo)上述上皮細(xì)胞因子的表達(dá)水平是否發(fā)生變化。在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，我們選擇EGFR信號(hào)通路阻斷劑PD153035和AG1478，及MEK信號(hào)通路阻斷劑U0126干預(yù)B

10、EAS-2B細(xì)胞，旨在觀察阻斷EGFR和MEK信號(hào)通路后，HDM誘導(dǎo)的IL-25、IL-33和TSLP的表達(dá)水平是否受影響。為了直觀地反應(yīng)ITLN是通過(guò)何種信號(hào)通路參與調(diào)控HDM誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞IL-25、IL-33和TSLP的表達(dá)，我們將BEAS-2B細(xì)胞在HDM干預(yù)前先轉(zhuǎn)染ITLN shRNA質(zhì)粒抑制ITLN的表達(dá)，用Western-Blot方法檢測(cè)EGFR和MAPK/ERK的磷酸化情況。
　　結(jié)果：在兩種小鼠哮喘模型中，我

11、們均發(fā)現(xiàn)抑制ITLN的表達(dá)后，小鼠肺組織中IL-25、IL-33和TSLP的表達(dá)水平被顯著抑制。用HDM連續(xù)三天致敏小鼠后，ITLN和上皮細(xì)胞因子IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而抑制ITLN的表達(dá)后，這些上皮細(xì)胞因子的表達(dá)也被抑制。在BEAS-2B細(xì)胞模型中，HDM刺激BEAS-2B細(xì)胞2h時(shí)，IL-33和TSLP的mRNA表達(dá)水平即開(kāi)始增加，6h時(shí)ITLN及IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表達(dá)水

12、平均增加，而用ITLN shRNA質(zhì)粒或半乳糖（galactose）干預(yù)后，HDM誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞引起的IL-25、IL-33和TSLP的表達(dá)受抑制。當(dāng)EGFR和MEK信號(hào)通路被阻斷后，HDM誘導(dǎo)BEAS-2B細(xì)胞IL-25、IL-33和TSLP的mRNA表達(dá)水平均明顯下降。隨后Western-Blot結(jié)果顯示，HDM刺激BEASA-2B細(xì)胞后能使EGFR和MAPK/ERK的磷酸化水平顯著增高，而轉(zhuǎn)染ITLN shRNA質(zhì)粒抑制I

13、TLN的表達(dá)后，EGFR和MAPK/ERK的磷酸化水平顯著下降。
　　結(jié)論：HDM能引起氣道上皮細(xì)胞 ITLN和固有免疫細(xì)胞因子 IL-25、IL-33和 TSLP的表達(dá)，當(dāng) ITLN的表達(dá)被抑制后，HDM誘導(dǎo)這些上皮細(xì)胞因子的表達(dá)也被抑制。ITLN通過(guò)參與EGFR和MAPK/ERK信號(hào)通路的活化調(diào)節(jié)HDM誘導(dǎo)的IL-25、IL-33和TSLP的表達(dá)。
　　第三部分 Intelectin在支氣管哮喘患者氣道中的表達(dá)及臨床意義

14、
　　目的：觀察 Intelectin（ITLN）在支氣管哮喘患者氣道中的表達(dá)情況，探究其與氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的相關(guān)性。
　　方法：我們一共入組23例健康對(duì)照者和48例支氣管哮喘患者，記錄所有研究對(duì)象的基本信息、肺功能FEV1%預(yù)計(jì)值、支氣管激發(fā)試驗(yàn)PD20值、外周血嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及血總IgE含量。此外，所有納入的研究對(duì)象均需留取誘導(dǎo)痰標(biāo)本、氣道刷片細(xì)胞及氣道活檢標(biāo)本。我們對(duì)誘導(dǎo)痰進(jìn)行處理后，對(duì)誘導(dǎo)痰中的細(xì)胞進(jìn)行分類計(jì)數(shù)

15、，并記錄嗜酸性粒細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的百分比。經(jīng)纖維支氣管鏡獲取的氣道活檢標(biāo)本需做石蠟包埋并切片，通過(guò)HE染色觀察氣道活檢標(biāo)本的結(jié)構(gòu)，對(duì)結(jié)構(gòu)清晰的組織切片做免疫組化觀察ITLN在健康對(duì)照者和支氣管哮喘患者氣道中的表達(dá)情況。經(jīng)纖維支氣管鏡獲取的氣道刷片細(xì)胞提取RNA，用real-time PCR法檢測(cè)并比較ITLN在健康對(duì)照組和支氣管哮喘組間的表達(dá)差異。同時(shí)檢測(cè)外周血中ITLN的蛋白表達(dá)水平，為血漿ITLN作為支氣管哮喘的生物標(biāo)志物提供依據(jù)。

16、最后，我們將支氣管哮喘患者氣道刷片細(xì)胞中ITLN mRNA的表達(dá)水平與誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量做相關(guān)性分析，了解ITLN與氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的相關(guān)性。
　　結(jié)果：健康對(duì)照組和支氣管哮喘組兩組在年齡和性別比上均無(wú)明顯差異。支氣管哮喘組的FEV1%預(yù)計(jì)值和支氣管激發(fā)試驗(yàn)PD20值均明顯低于健康對(duì)照組。而支氣管哮喘組外周血嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量及血總IgE含量均明顯高于健康對(duì)照組。免疫組化法檢測(cè)的氣道活檢標(biāo)本結(jié)果顯示，ITLN主要表達(dá)在支氣

17、管哮喘患者的氣道杯狀細(xì)胞和氣道粘膜下腺體內(nèi)。支氣管哮喘組的氣道刷片細(xì)胞中ITLN的mRNA表達(dá)水平和外周血中ITLN的蛋白表達(dá)水平均明顯高于健康對(duì)照組。通過(guò)相關(guān)性分析，我們還發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘患者氣道刷片細(xì)胞中ITLN的mRNA表達(dá)水平與誘導(dǎo)痰中嗜酸性粒細(xì)胞百分比呈顯著正相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)為0.622，P<0.0001）。
　　結(jié)論：ITLN在支氣管哮喘患者的氣道中表達(dá)明顯升高，且主要表達(dá)在氣道杯狀細(xì)胞和氣道粘膜下腺體內(nèi)。支氣管哮喘患