伯克霍爾德菌的篩選、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)低溫脂肪酶的研究.pdf

1、脂肪酶能夠催化甘油三酰酯水解，是重要的工業(yè)用酶之一。低溫脂肪酶在低溫下具有高催化活性的特點，具有廣闊的應用前景。低溫脂肪酶多為低溫微生物產(chǎn)生，此類菌生長條件相對苛刻，嚴重制約了低溫脂肪酶的發(fā)展。因此，篩選和研究產(chǎn)低溫脂肪酶的嗜溫菌具有一定的理論意義和潛在的應用價值。
　　 從銀杏果實中篩選得到一株穩(wěn)定產(chǎn)低溫脂肪酶的伯克霍爾德菌，并對其進行了鑒定，研究了其發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的條件、脂肪酶的分離純化和性質(zhì)以及烷烴類物質(zhì)對該菌產(chǎn)脂肪酶的影響

2、和機理，并對該基因進行克隆、表達及序列分析，主要結(jié)果如下：
　　 1)利用維多利亞B平板顯色特征和產(chǎn)脂肪酶能力測定，篩選得到一株產(chǎn)脂肪酶的菌株，經(jīng)形態(tài)學、分子生物學、DNA GC含量和脂肪酸含量的鑒定，命名為Burkholderia sp. SYBC LIP-Y，其16S rRNA基因序列的GenBank登錄號為FJ392830。
　　 2)用響應面法對Burkholderia sp. SYBC LIP-Y液體發(fā)酵產(chǎn)低溫

3、脂肪酶的發(fā)酵條件進行了快速優(yōu)化。首先利用Plackett-Burman設計對影響其產(chǎn)酶相關因素進行評估并篩選出具有顯著效應的三個因素：牛肉膏，橄欖油，Triton X-100;用最陡爬坡路徑逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域后，利用響應面中心組合設計對顯著因素進行優(yōu)化，確定出牛肉膏，橄欖油，Triton X-100的最佳濃度分別為：牛肉膏31.8g/L、橄欖油21mL/L、Triton X-10036.55mL/L，優(yōu)化后脂肪酶的酶活達到61.52U/m

4、L，是優(yōu)化前的2.62倍。對5L發(fā)酵罐中Burkholderia sp. SYBC LIP-Y的發(fā)酵產(chǎn)酶條件和工藝進行了優(yōu)化，確定了最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基以及發(fā)酵工藝參數(shù)：接種量為10％, Triton X-1005mL/L，橄欖油10mL/L、牛肉膏40g/L、攪拌速度為300r/min，通氣量為3.5L/min，在此培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)36h產(chǎn)酶達到高峰值，產(chǎn)酶水平與搖瓶培養(yǎng)基相當，發(fā)酵時間縮短了12h。
　　 3)通過雙水相系統(tǒng)、DE

5、AE-cellulos52和Sephadex G-75分子篩層析純化得到的脂肪酶進行酶學性質(zhì)研究，確定該酶反應的最適pH值為10.0，最適溫度為30℃，40℃下保溫60min酶活性還有70％以上，該脂肪酶為低溫脂肪酶，熱穩(wěn)定性好，具有一定的耐醇性；蛋白分子量為36kDa; Na+、Mg2+對脂肪酶的活力有明顯的促進作用，Cu2+和Zn2+對脂肪酶的活力有明顯的抑制作用；非離子型表面活性劑Tween-40和Tween-60對脂肪酶活性有顯

6、著的的激活作用，Tween-80對脂肪酶的活性有一定的抑制作用；最適作用底物為p-NPB，Km值為0.120mmol/L,Vmax為400U/mg, Kcat為240 S-1。
　　 4)考察了短鏈烷烴和長鏈烷烴對菌株Burkholderia sp. SYBC LIP-Y的搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，結(jié)果表明，短鏈烷烴庚烷、辛烷、癸烷對菌株產(chǎn)脂肪酶具有非常大的抑制作用，長鏈烷烴十二烷、十四烷、十六烷對Burkholderia sp. S

7、YBC LIP-Y產(chǎn)脂肪酶具有很明顯的刺激作用，添加4％(v/v)的十二烷的發(fā)酵液的酶活是對照組酶活的2倍左右。在脂肪酶酶活提高時，氧化水平提高，丙二醛、H2O2、抗壞血酸含量以及SOD、CAT活力明顯上升，可能由于長鏈烷烴作用于細胞膜上，從而啟動了抗氧化機制，促進了信號傳遞，因此促進Burkholderia sp. SYBC LIP-Y產(chǎn)脂肪酶的機制可能與抗氧化機制有關。
　　 5)經(jīng)PCR擴增得到脂肪酶基因，與Burkhol